Анотація до роботи:

Рзаєва О.М. -L-Рамнозидаза Penicillium commune 266. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена одержанню та дослідженню гідролітичного ферменту -L-рамнозидази грибного походження. Штам-продуцент P. commune 266 було відібрано в результаті поетапного скринінгу серед 692 культур грибів та бактерій. Було вивчено трофічні потреби продуценту та оптимізовано умови культивування позаклітинної -L-рамнозидази. Розроблено схему очистки та отримано два ферментні препарати з -L-рамнозидазною активністю 157 та 51 од/мг білка, відповідно. Встановлено, що деякі похідні порфіринів і комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами можуть бути використані як індуктори біосинтезу (180-430 %), а також стимулятори активності (до 45,6 %) a-L-рамнозидази P. commune 266. Досліджено фізико-хімічні та каталітичні властивості ферментів, специфічність дії. Встановлено, що препарати характеризуються високим вмістом гідрофобних (25 та 36 %) та основних амінокислот (29 та 24%), відповідно для препаратів 1 і 2, а також присутністю в їх вуглеводному компоненті у препараті 1 - галактози, манози, рамнози та глюкозаміну, та галактози і рамнози – у препараті 2. Ферментний препарат 2 проявляє вузьку специфічність щодо глікону, а препарат 1 – широку. -L-Рамнозидази 1 та 2 P. commune 266 інгібуються значними концентраціями синтетичного субстрату та продуктом реакції L-рамнозою. Молекули ферментів не містять атомів металу. Показано, що в активному центрі -L-рамнозидази 1 та 2 присутні карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти та імідазольна група гістидину. Сульфгідрильні групи не беруть участі у каталізі, але можливо відіграють важливу роль у підтриманні активної конформації білкової молекули.

Робота містить наукові положення і результати, які вказують на те, що P. commune 266 продукує дві високоефективні a-L-рамнозидази – 1 і 2. Висока ферментативна активність, особливості фізико-хімічних властивостей, широка субстратна специфічність a-L-рамнозидази 1 і вузька - a-L-рамнозидази 2 є основою їх застосування при проведенні структурних аналізів, отриманні речовин, які придатні для використання в медицині, фармакології, косметології та харчовій промисловості, що відкриває нові, перспективні напрями в мікробній біотехнології України.

Основні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Вивчення a-L-рамнозидазної активності у 692 культур мікроорганізмів — представників 58 родів мікроміцетів і 1 роду бактерій свідчить, що найбільша кількість культур, у яких виявлена здатність продукувати фермент, є представниками мікроміцетів, що належать до родів Aspergillus, Myrothecium, Penicillium, Eupenicillium, Fusarium, а також Undetermined fungus. Найбільш високим рівнем активності і стабільності ферменту характеризувався P. commune 266, ізольований з шампіньйонних компостів. Він був використаний як продуцент a-L-рамнозидази при одержанні ферментних препаратів.

2. Внаслідок оптимізації умов культивування P. commune 266 математичними методами вдалося підвищити рівень активності a-L-рамнозидази в культуральній рідині приблизно в 3,0 рази.

3. Вперше встановлено, що ряд синтетичних речовин (похідні порфірину, флуорену та комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами) здатні збільшувати активність a-L-рамнозидази у культуральній рідині в 1,8–4,3 рази.

4. Розроблено схему виділення з культуральної рідини та очистки ферментного препарату, яка включає фракціонування сульфатом амонію, іонообмінну хроматографію на DEAE-TSK 650 М гелі, внаслідок якої препарати a-L-рамнозидази 1 і 2 було очищеного в 210 та 67 разів, питома активність їх складає 157 та 51 од/мг білка, відповідно.

5. Встановлено, що оптимальними умовами для гідролізу відповідних синтетичних субстратів ферментними препаратами є значення рН 4,0-4,2, температури 60 ^оС. Ферментні препарати стабільні при температурі від 0 C до 20 C в діапазоні рН від 3,0 до 6,0. Молекулярна маса a-L-рамнозидази 1 і 2 за даними гель-фільтрації на сефарозі 6В становить 120 та 105 кДа, відповідно.

6. В молекулах a-L-рамнозидази 1 і 2 переважають основні (29 та 24 %) та гідрофобні (25 та 36 %) амінокислоти, присутні також кислі амінокислоти (10 та 13 %) (відповідно). В обох препаратах ферментів визначено 2% вуглеводів, які представлені в препараті 1 галактозою, манозою, рамнозою та глюкозаміном, а в препараті 2 - галактозою та рамнозою.

7. Встановлено, що ферментні препарати P. commune 266 проявляють специфічність відносно термінальної a-1,2-зв’язаної L-рамнози природних субстратів, а також синтетичних п-нітрофенільних похідних відповідних глікозидів. Препарат 2 характеризувався вузькою субстратною специфічністю (гідролізував тільки a- L-рамнозиди), препарат 1 володів більш широкою субстратною специфічністю і був здатним відщеплювати b-D-глюкозу, b-D-ксилозу, a-D-манозу, a-D-галактозу, N-ацетил-b-D-глюкозамінід від відповідних п-нітрофенільних похідних.

8. Показано, що ферменти P. commune 266 є металонезалежними, в їх молекулах відсутні іони металів. Досліджені іони металів у концентраціях 10^-3-10^-4 М по-різному впливали на ферментативну активність препаратів: від стимуляції до повного інгібування.

9. Встановлено, що каталітично активними групами ферментних препаратів P. commune 266, які відповідають за прояв a-L-рамнозидазної активності, є карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти (можливо аспарагінової або глутамінової) та імідазольна група гістидину. Виявлено наявність поза активним центром ферменту SH-груп, важливих для прояву a-L-рамнозидазної активності.

Публікації автора:

1. Рзаєва О.М., Борзова Н.В., Варбанець Л.Д., Соколова О.В., Харкевич О.С., Жданова Н.М., Сафронова Л.А. Скринінг мікроорганізмів – продуцентів -L-рамнозидази // Мікробіол. журн. – 2005.– Т. 67, №5. – С.19-27. (Здобувачем особисто був проведений скринінг продуцентів -L-рамнозидази серед 543 штамів мікроміцетів, та 149 штамів бактеріальних культур. Досліджено фізико-хімічні властивості та спектр глікозидазних активностей у 7 найбільш активних штамів. Відібрано штам Penicillium соmmune (syn. P. palitans) 266 як продуцент -L-рамнозидази).

2. Рзаєва О.М., Варбанець Л.Д. -L-рамнозидаза мікроорганізмів // Мікробіол. журн. – 2006.– Т. 68, №1. – С.69-84. (Здобувачем особисто висвітлені питання щодо поширення -L-рамнозидази у природі, її біологічної ролі та особливостей біосинтезу. Охарактеризовані традиційні та сучасні підходи щодо виділення та очистки мікробних -L-рамнозидаз, розглянуто механізм каталітичної дії глікозидаз, порівняно фізико-хімічні властивості -L-рамнозидаз різного походження, їх субстратну специфічність. Наведені дані щодо вивчення регуляції синтезу -L-рамнозидаз, висвітлено деякі аспекти їх практичного застосування).

3. Рзаєва О.М., Варбанець Л.Д. Оптимізація умов культивування Penicillium palitans штаму 266, що синтезує -L-рамнозидазу // Мікробіол. журн. – 2006.– Т. 68, №6. – С.10-20. (Здобувачем особисто вивчено трофічні властивості продуцента P.соmmune (раніше P. palitans), за допомогою методів математичного планування експериментів здійснено оптимізацію поживного середовища та режиму ферментації).

4. Варбанец Л.Д., Рзаева О.Н., Мишак Е.В., Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Песарогло А.Г. Влияние координационных соединений германия на активность ряда гликозидаз // Мікробіол. журн. – 2007.– Т. 69, №3. – С.11-19. (Здобувачем особисто досліджено вплив координаційних сполук германію з оксикислотами на біосинтез та активність -L-рамнозидази).

5. Варбанець Л.Д., Рзаєва О.М., Сейфулліна І.Й., Марцинко О.Е., Пєсарогло А.Г., Філіппова Т.О., Жилина З.І., Ішков Ю.В., Карпенко О.В., Шульга О.М. Індукція синтезу та активація -L-рамнозидази // Укр. біохім. журн. – 2007. – Т. 79, № 4. – С. 19-29. (Здобувачем особисто досліджено вплив комплексів бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами, синтетичних похідних порфіринів та флуорену, а також поверхнево-активних речовин на біосинтез та активність препаратів -L-рамнозидази, розроблено схему виділення та очистки ферментів).

6. Рзаєва О.М. Позаклітинна -L-рамнозидаза мікроміцетів // Материалы ІX Українського біохімічного з’їзду (Харків, 24-27 жовтня 2006 р.). Стенд. доп.: Харків, - 2006. – С. 62.

7. Рзаєва О.М., Мишак К.В., Варбанець Л.Д., Сейфуллина І.Й., Марцинко О.Є. Вплив координаційних сполук германію на активність -L-рамнозидази Penicillium palitans та -амілаз Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis // Тези доповідей. Міжнародна наукова конференція “Мікробні біотехнології” 11-15 вересня 2006 р. Одеса, “Астропринт” 2006. – С.140.

8. Рзаєва О.М. Виділення та очистка позаклітинної -L-рамнозидази // Матеріали ІІІ Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 23-27 квітня, 2007). – С.363.

9. Rzaeva O.N. Penicillium commune -L-rhamnosidases // Modern problems of microbiology and biotechnology (Odessa, 28-31, May 2007). – Odessa, 2007. - P. 125.