Борзова Н.В. a-N-ацетилгалактозамінідаза та a-галактозидаза Aspergillus niger 185ш. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.
Дисертація присвячена виділенню та дослідженню ферментного препарату з a-N-ацетилгалактозамінідазною та a-галактозидазною активностями. Штам-продуцент A. niger 185ш було відібрано в результаті поетапного скринінгу серед 1514 культур мікроміцетів, бактерій та дріжджів. Було вивчено трофічні потреби продуцента та вплив різних факторів на процес біосинтезу позаклітинних a-N-ацетилгалактозамінідази та a-галактозидази. Були виявлені ряд природних (суха бичача кров, глюкоза, мальтоза та сахароза) та синтетичних (гуанідин карбонат, нітроаміногуанізон саліцилового та диметиламінобензальдегідів, координаційні сполуки германію з янтарною та оксіетилімінодіоцтовою кислотами) речовин, здатних спричиняти активуючий вплив на біосинтез ферментів. Додавання цих сполук до середовища росту збільшувало секрецію a-N-ацетилгалактозамінідази та a-галактозидази на 50 – 200 %. Здійснена очистка в 600 разів та отримано ферментний препарат з a-галактозидазною та a-N-ацетилгалактозамінідазною активностями 25 та 10,5 Е/мг білка, відповідно. Були досліджені фізико-хімічні та каталітичні властивості ферменту, специфічність його дії. Встановлено, що препарат характеризується високим вмістом гідрофобних та кислих амінокислот, а також присутністю манози, галактози, глюкозаміну та двох неідентифікованих гексозамінів в його вуглеводному компоненті. Фермент проявляє вузьку специфічність щодо глікону. a-N-ацетилгалактозамінідазна та a-галактозидазна активності препарату A. niger 185ш інгібуються відповідними синтетичними субстратами та продуктами реакції: N-ацетилгалактозаміном та D-галактозою. Молекула ферменту не містить атомів металу. a-N-Ацетилгалактозамінідазна реакція активується іонами германію (ІV) на фоні пригнічення a-галактозидазної активності ферменту. Показано, що в активному центрі глікозидази присутні карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти та імідазольна група гістидину. Сульфгідрильні групи не беруть участі у каталізі, але відіграють важливу роль у підтриманні активної конформації білкової молекули. Препарат ферменту був нетоксичним, але проявляв пірогенні властивості. Встановлено серологічну спорідненість між ферментом A. niger та a-галактозидазою С. cladosporioides.
В результаті скринінгу серед 1514 культур мікроорганізмів — представників 32 родів мікроміцетів, 14 родів дріжджів та 6 родів бактерій, a-N-ацетилгалактозамінідазна активність була виявлена у штамів, що належали до родів Aspergillus, Eurotium, Penicillium та Arthrobacter. Відібрано штам Aspergillus niger 185ш, який відрізнявся високим рівнем активності a-N-ацетилгалактозамінідази та a-галактозидази (0,142 та 0,7 Е/мл, відповідно).
Внаслідок оптимізації умов культивування штаму Aspergillus niger 185ш вдалося підвищіти рівень активності a-N-ацетилгалактозамінідази та a-галактозидази в культуральній рідині в 1,5 та 2,0 рази, відповідно.
Вперше встановлено, що ряд природних (суха бичача кров, глюкоза, мальтоза, сахароза) та синтетичних (гуанідин карбонат, нітроаміногуанізон саліцилового та диметиламінобензальдегідів, координаційні сполуки германію з янтарною та оксіетилімінодіоцтовою кислотами) речовин здатні активувати синтез a-N-ацетилгалактозамінідази та a-галактозидази на 50 - 200 %.
Розроблено методи виділення з культуральної рідини та очистки ферментного препарату, які включають фракціонування сульфатом амонію, аніонообмінну та гель-фільтрацію на TSK-гелях. Питома a-N-ацетилгалактозамінідазна та a-галактозидазна активність очищеного в 600 разів препарату складає 10,5 та 25 Е/мг білка, відповідно.
Встановлено, що оптимальними умовами для гідролізу відповідних синтетичних субстратів ферментним препаратом є значення рН 3,5-4,1, температури 60 оС. Ферментний препарат стабільний при t від 0 до 20 оС в діапазоні рН від 3,0 до 7,0. Показана субодинична структура молекули ферменту, його молекулярна маса за даними гель-фільтрації на сефарозі 6В становить 430 кДа, за даними ДСН-ПААГ - 70 кДа. В молекулі ферменту переважають кислі (20 %) та гідрофобні (30 %) амінокислоти, а також присутній вуглеводний компонент, представлений манозою, галактозою, глюкозаміном та двома неідентифікованими гексозамінами.
Встановлено, що ферментний препарат A. niger 185ш проявляє вузьку специфічність відносно глікону.
Показано, що фермент A. niger 185ш є металонезалежним, в його молекулі відсутні іони металів. Досліджені іони металів не впливали на ферментативну активність препарату, за винятком іонів Ge4+, який мав активуючу дію щодо a-N-ацетилгалактозамінідази, але одночасно інгібував a-галактозидазну активність.
Встановлено, що каталітично активними групами ферментного препарату A. niger 185ш, які відповідають за прояв a-N-ацетилгалактозамінідазної та a-галактозидазної активності, є карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти (можливо аспарагінової або глутамінової) та імідазольна група гістидину. Виявлено наявність поза активним центром ферменту SH-груп, важливих для прояву a-галактозидазної активності, але не суттєвих для a-N-ацетилгалактозамінідазної.
Вперше встановлено серологічну спорідненість між глікозидазами A. niger 185ш та C. cladosporioides 189.
Показано, що препарат ферменту є нетоксичним (500 мг/кг ваги), але пірогенним (0,04 мг/кг ваги).
Одержання високоактивного ферментного перпарату з a-N-ацетилгалактозамінідазною та a-галактозидазною активностями та дослідження його властивостей створює передумови для впровадження в Україні новітніх медичних біотехнологій.
3. Борзова Н.В. Вплив деяких цукрів на синтез a-N-ацетилгалактозамінідази та a-галактозидази Aspergillus niger // Науковий вісник Ужгородського університету. – Серія “Біологія” - № 10. -Ужгород, 2001. – С. 130-132.
4. Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Батракова О.Л., Борзова Н.В., Иванко Е.В., Варбанец Л.Д. Влияние координационных соединений германия на синтез и активность ферментов // Мікробіол. журн. – 2002. - 64, №4. – С. 3-11.
5. Борзова Н.В., Варбанец Л.Д., Маланчук В.М., Школьный А.Т., Жданова Н.Н. Грибная a-N-ацетилгалактозаминидаза // Материалы международной конференции “Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия” (Мінськ, 1-2 червня 2000) –Тез. доп.: Минск, 2000. – С.106-107.
7. Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Батракова О.Л., Борзова Н.В., Иванко Е.В., Варбанец Л.Д. Координационные соединения германия как эффекторы синтеза и активности ферментов // Материалы XX международной Чугаевской конференции по координационной химии (Ростов-на-Дону, 25-29 червня 2001г.)- Тез.доп.: Ростов-на-Дону, - 2001. – С. 401.
8. Borzova N.V., Varbanets L.D., Seifullina I.I., Zubkov S.V. a-Galactosidase and a-N-acetylgalactosaminidase of Aspergillus niger // Glycoconjugate J. - XVI International Symposium on Glycoconjugates: Proc. (Hague, Netherlands, 19-24 August, 2001). –2001. - V. 18, № 1/2. – P. 108.
9. Borzova N.V., Malanchuk V.M., Varbanets L.D. The studies of functional groups of fungal a-galactosidases active center // 11th European carbohydrate symposium Eurocarb XI – Proc. (Lisboa, Portugal, 2-7 September, 2001) – Lisboa, 2001. – P. 385.
10. Борзова Н.В., Варбанец Л.Д. Выделение и характеристика грибных гликозидаз — a-N-ацетилгалактозаминидазы и a-галактозидазы //Укр. біохім. журн. – 2002. – 74, № 4б. - Матеріали VIII Українського Біохімічного з’їзду (Чернівці, 2002) – С.151.
