Анотація до роботи:

Галицький В.А. Біоінформатичний аналіз молекулярних механізмів диференціації лімфоїдних клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.

Дисертація має на меті встановлення загальних принципів будови генної мережі диференціації клітин та з’ясування участі мікроРНК у її функціонуванні, а також деталізації і реконструкції молекулярних механізмів лімфопоезу. Показано, що в інтерферуючих РНК (коротких інтерферуючих РНК та мікроРНК) частота зустріваності динуклеотидів 5’-CG-3’ та тринуклеотидів 5’-CNG-3’ набагато перевищує випадковий рівень. На підставі цього запропоновано механізми ініціації інтерферуючими РНК метилювання ДНК de novo та алельного виключення. Розглянуто еволюційні передумови та механізми виникнення генної мережі диференціації клітин. Висунуто концепцію модулів генів, згідно якої дана мережа повинна складатися з окремих елементарних одиниць (модулів генів), керованих позитивним зворотнім зв’язком і відповідальних кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини. Реконструйовано структуру генної мережі В-лімфопоезу та завершального етапу Т-лімфопоезу. Встановлено можливу роль мікроРНК miR-181 та miR-150 у регуляції експресії генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 і генів транскрипційних факторів Bcl6 та MITF. Узагальнено також імовірну роль мікроРНК у диференціації клітин та підтриманні стабільності їх геному.

Диференціація лімфоїдних клітин є складним багатостадійним процесом, здійснення якого забезпечується узгодженою активністю численних генів, внутрішньоклітинних та позаклітинних сигнальних каскадів, залученням епігенетичних механізмів регуляції експресії генів. У дисертаційній роботі запропоновано гіпотезу про будову і принципи функціонування генної мережі диференціації клітин, що включає у себе пояснення механізму RNAi-опосередкованого транскрипційного сайленсингу і алельного виключення. Основні положення даної гіпотези викладені у наступних висновках:

1. Частота зустріваності динуклеотидів 5’-CG-3’ та тринуклеотидів 5’-CNG-3’ у інтерферуючих РНК (siRNA та miRNA) набагато перевищує випадкову, а частка інтерферуючих РНК, цілковито позбавлених зазначених сайтів, становить лише 15-20%. Дані сайти комплементарні сайтам ДНК, у яких у ході транскрипційного сайленсингу, викликаного гібридизацією інтерферуючої РНК з ДНК, ініціюється метилювання залишків цитозину de novo.

2. Алельне виключення генів досягається через мічення одного з алелів епігенетичними маркерами репресії, ініціатором чого виступає молекула miRNA, котра утворюється в результаті процесингу некодуючого транскрипта алелів та зв’язується з їх ДНК. Алельне виключення виникло в процесі еволюції з метою репресії множинних копій мобільних елементів геному. Реставрація втраченої епігенетичної інформації та необмежений за тривалістю сайленсинг мобільних елементів геному забезпечуються метилюванням ДНК de novo, що ініціюється набором наявних у недиференційованих клітинах miRNA.

3. Генна мережа диференціації клітин складається з окремих елементарних функціональних одиниць – модулів генів, керованих позитивним зворотнім зв’язком і відповідальних кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини за принципом “один етап диференціації – один модуль генів”. Еволюційною передумовою виникнення даної мережі було вбудовування сайтів транскрипційних факторів у регуляторні ділянки генів завдяки механізмам рекомбінації.

4. Реконструйована нами структура генної мережі, котра забезпечує дозрівання В-лімфоцитів, та генної мережі, яка координує завершальний етап спеціалізації Т-клітин, відповідає структурі, очікуваній у рамках гіпотези про будову генної мережі диференціації клітин.

5. Одним з найперших регуляторних рівнів при диференціації клітин є зміна спектру наявних у них miRNA, внаслідок якої уможливлюється експресія генів, відповідальних за процеси спеціалізації. Зокрема, молекулярною основою переходу лімфоцитів на стадію незрілих/зрілих В-клітин є припинення експресії гена мікроРНК miR-181.

6. Тимчасове пригнічення експресії генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 на стадії преВІ-клітин обумовлюється сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив мікроРНК miR-181, а остаточна інактивація рекомбіназ на стадії зрілих В-лімфоцитів – сайленсингом даної мРНК через вплив мікроРНК miR-150.

Дані положення можуть бути перевірені експериментально, зокрема здатність miRNA зв’язуватись з комплементарними ділянками ДНК та ініціювати метилювання сайтів 5’-CG-3’ і 5’-CNG-3’ у них, і це буде завданням наступних досліджень.

Публікації автора:

1. Галицкий В.А. Детерминация и дифференцировка клеток: концепция кластеров генов // Цитология.– 2001.– Т.43, № 10.– С.913-925.

2. Галицький В.А. Пухлинний ріст – результат випадіння клітин з процесів диференціації // Вісник наукових досліджень.– 2001.– № 1 (21).– С.112-117.

3. Галицкий В.А. Старение и рост онкозаболеваемости: возможные молекулярные механизмы взаимосвязи // Пробл. старения и долголетия.– 2001.– Т.10, №2.– С.201-224.

4. Галицкий В.А. Канцерогенез и механизмы внутриклеточной передачи сигналов // Вопросы онкологии.– 2003.– Т.49, № 3.– С.278-293.

5. Галицкий В.А. Внутриклеточные и межклеточные пути передачи сигналов и возрастные изменения пролиферативной активности и интенсивности апоптоза клеток иммунной системы // Цитология.– 2005.– Т.47, № 4.– С.283-295.

6. Галицький В.А., Комісаренко С.В. Деякі механізми диференціації лімфоїдних клітин // Укр. біохім. журн.– 2007.– Т.79, №4.– С.5-17.

7. Halytskiy V.A. Hypothesis of initiation of DNA methylation de novo and allelic exclusion by small RNAs // Cell Tissue Biol.– 2008.– Vol. 2, No. 2.– P.97-106.

8. Галицький В. Кластери генів як складові елементи фрактальної структури генної системи, що контролює процеси диференціації та детермінації клітин // Тези доповідей 2-го Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених.– Тернопіль: Укрмедкнига, 1998.– C.36-37.

9. Halytskiy V.A. Cluster conception of cell differentiation // Conference on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology. Abstract book.– Kiev (Ukraine), 2001.– P.40.

10. Галицький В.А. Диференціація клітин з точки зору концепції кластерів генів та біологічний зміст стадій канцерогенезу // Укр. біохім. журн.– 2002.– Т.74, №4а (додаток 1).– С.34.

11. Halytskiy V.A. Determination of malignant or non-malignant phenotype of tumour cells.// Eur. J. Cancer Suppl.– 2004.– Vol. 2, № 1.– P.50-51.

12. Halytskiy V.A. Avoidance of transforming cells from differentiation as third stage of carcinogenesis // Proceedings of the 18^th Meeting of the European Association for Cancer Research.– Innsbruck (Austria), 2004.– P. 116-117.

13. Halytskiy V.A. Gene networks of cell differentiation and phenomenon of tumour growth // Ukrainian Biochem. J.– 2005.– Vol. 77, № 2 (special issue).– P.111.

14. Halytskiy V.A. The mathematical model of the gene network controlling terminal CD4⁺-lymphocytes differentiation // 1^st International Symposium on Methods and Applications of Computational Chemistry.– Kharkiv (Ukraine), 2005. – P.34.

15. Halytskiy V.A. Theoretical approach to tumour growth management // Proceedings of the 19^th Meeting of the European Association for Cancer Research.– Budapest (Hungary), 2006.– P. 282.

16. Halytskiy V.A. Modeling the gene network of cell differentiation // Differentiation.– 2006.– Vol. 74.– P. 476.

17. Галицький В.А. Генна мережа диференціації лімфоїдних клітин: відповідність теоретичним передбаченням.// Матеріали IX З’їзду Українського біохімічного товариства.– Харків, 2006.– С.15.

18. Halytskiy V.A. Small RNA can initiate DNA methylation de novo // Acta Biochimica Polonica.– 2007.– Vol. 54, Suppl., № 2.– P.5.3.

19. Halytskiy V.A. Mechanism of the initiation of DNA methylation de novo by small RNA // Eur. J. Cancer Suppl.– 2007.– Vol. 5, No. 4. – P. 75.