Анотація до роботи:

Похил С.І. Біологічні властивості та медичне значення ентеробактерій видів Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica. –Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню ареалу циркуляції на території України видів ентеробактерій R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, вивченню їх біологічних властивостей, розробці методів виділення та ідентифікації цих мікроорганізмів, поглибленню знань про їх медичне значення. Визначена частота і рівень контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями зразків об’єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу від хворих і здорових людей. Вивчені біологічні властивості референтних та регіональних штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, розроблені методи їх виділення та ідентифікації. Доведена наявність і визначено рівень активності факторів патогенності у рахнел. Розроблено етіологічні критерії та метод мікробіологічної діагностики захворювань спричинених R. aquatilis.

В дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і вирішення наукової проблеми встановлення ареалу циркуляції на території України та вивчення біологічних (фенотипових і генотипових) властивостей видів ентеробактерій: R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica. Розроблено методи їх виділення із об’єктів оточуючого середовища та із зразків клінічного матеріалу, а також схеми ідентифікації цих мікроорганізмів. Встановлено наявність і визначений рівень активності факторів патогенності у R. aquatilis та обґрунтовано комплекс етіологічних критеріїв для діагностики ГКІ, обумовлених цими бактеріями. Розроблено метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis, в тому числі способи внутрішньовидового фено- і генотипування збудника.

1. Вперше встановлено, що територія України (Харківська, Полтавська, Сумська області) є ареалом циркуляції видів ентеробактерій R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica. Визначена частота і рівень контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями зразків об’єктів оточуючого середовища (води, ґрунту, харчової сировини, продуктів харчування, змивів із холодильного і торгівельного обладнання) та різного клінічного матеріалу (крові, спино-мозкової рідини, харкотиння, сечі, випорожнень) від хворих і клінічно здорових людей.

2. Показано, що найчастіше (P<0,05) R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica виявляли в зразках води із відкритих водойм (в 14,6, 27,0 і 25,0 %, відповідно), тоді як із питної колодязної та водогінної води ці бактерії виділяли значно рідше. За частотою і рівнем контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями, об’єкти оточуючого середовища складають таку послідовність: вода, грунт, харчова сировина та продукти харчування, змиви із холодильного і торгівельного обладнання. Серед досліджених зразків клінічного матеріалу R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica були виділені із випорожнень хворих на ГКІ (з частотою 5,6, 1,4 і 0 %, відповідно) та клінічно здорових людей (з частотою 2,0, 1,0 і 3,0 %, відповідно). На відміну від прагій та будвіцій, рахнели також були ізольовані із (3,8 %) зразків крові від хворих із проявами сепсису.

3. Вивчено біологічні (фенотипові та генотипові) властивості референтних і виділених на території України 28 штамів P. fontium, 32 штамів B. aquatica та 58 штамів R. aquatilis. Морфологія клітин, тинкторіальні, культуральні, біохімічні і генетичні властивості прагій, будвіцій та рахнел відповідають основним характеристикам родини Enterobacteriaceae. На основі отриманих результатів, розроблено методи виділення цих мікроорганізмів із зразків об’єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу, схеми ідентифікації прагій, будвіцій і рахнел, в тому числі й таблиці для їх диференціації з іншими подібними за властивостями родами, видами та біогрупами ентеробактерій.

4. Найважливішими фенотиповими особливостями P. fontium і B. aquatica є рухливість при t^o = (25-37) ^oC, здатність утворювати сірководень при дисиміляції білку та відносно низький рівень ферментативної активністі в цілому. Нуклеотидний склад хромосомної ДНК у досліджених штамів P. fontium містить (46,7±0,7), а у штамів B. aquatica - (46,5±1,0) моль % Г+Ц. За рівнем геномної подібності щодо вмісту Г+Ц в хромосомній ДНК, прагії та будвіції запропоновано віднести до “ядра” представників Enterobacteriaceae, яке об’єднує роди Budvicia-Yersinia-Pragia. Рівень гомології між ДНК штамів P. fontium і E. Coli K-12 визначений у межах (3-5) %, а між ДНК штамів B. aquatica і E. coli K-12 не перевищував (1-3) %.

5. Найважливішими фенотиповими особливостями переважної більшості штамів R. aquatilis є рухливість при t^o = (22-25) ^oC і втрата цієї властивості при t^o = (35-37) ^oC, здатність продукувати фенілаланіндезаміназу та високий рівень ферментативної активності в цілому. Нуклеотидний склад хромосомної ДНК у досліджених штамів R. aquatilis містить (51-58) моль % Г+Ц. За рівнем геномної подібності щодо вмісту Г+Ц в хромосомній ДНК, рахнели запропоновано віднести до “ядра” представників Enterobacteriaceae, яке об’єднує роди Rahnella-Klebsiella-Enterobacter-Pantoea. Рівень гомології між ДНК штамів R. aquatilis і E. coli K-12 визначений у межах (14-19) %. Встановлено, що вид R. aquatilis є досить гетерогенною групою мікроорганізмів за біохімічними, антигенними і генетичними властивостями.

6. Вперше встановлено наявність і визначено рівень активності ФП, які забезпечують здатність R. aquatilis, прикріплятися, колонізувати та здійснювати інвазію в тропні тканини організму хазяїна, протистояти його гуморальним і клітинним факторам захисту та розмножуватись in vivo, спричинювати розвиток патологічних процесів, притаманних перебігу рахнельозної інфекції. Антагоністичні взаємовідносини між R. aquatilis та іншими видами бактерій індигенної мікрофлори людини можуть бути результатом прояву бактеріоциногенії, негативного хемотаксису та продукції бактерійного лізоциму. Штами рахнел різного походження проявляли високий рівень адгезивності, продукували такі ФА, як протеїназа, нейрамінідаза, желатиназа, гіалуронідаза, фосфатаза, фенілаланіндезаміназа, РНК-аза, твін-60- і твін-80-естераза. Рахнели характеризуються помірним рівнем резистентності до БАС, фагоцитарної активності ПМЯЛ периферійної крові людей, відносно високим рівнем АКА та помірним рівнем АЛА. Як і багато інших представників родини Enterobacteriaceae, рахнели інтенсивно синтезують ендотоксини – ЛПЦ О-антигену. Вперше, при дослідженні зразків ЛПЦ, отриманих із різних штамів R. aquatilis, встановлена варіабельність О-специфічних поліцукридних ланцюгів та інших структурних компонентів макромолекули ЛПЦ рахнел, що дозволяє їм “обходити” механізми імунного захисту організму хазяїна. Штами R. aquatilis різного походження характеризуються відносно невисоким рівнем гемолітичної і гемопротеїназної активності, продукуючи a- і a’- гемолізини, в тому числі тіолзалежні. Встановлена загальна закономірність зростання інтенсивності дії ФП (за винятком АЛА) при зниженні температури від (37±0,5) до (25±0,5) ^оС, що свідчить про активний вплив терморегуляції на механізм експресії генетичних детермінант ФП і відображає особливості життєдіяльності рахнел як психрофільних мікроорганізмів - співчленів природних біоценозів води та ґрунту.

7. Розроблено і випробувано технологію отримання кролячих неадсорбованих і адсорбованих ОН-аглютинуючих сироваток для ідентифікації штамів R. aquatilis. Показано, що штами-продуценти гомологічних антигенів - R. aquatilis АТСС 33071 і АТСС 33989 характеризуються високою імуногенністю, а штам-продуцент гетерологічних антигенів - E. cloaceae №1903 – вираженими адсорбційними властивостями. Результати досліджень властивостей експериментальних зразків неадсорбованих і адсорбованих ОН-аглютинуючих сироваток підтвердили можливість їх використання для мікробіологічної діагностики рахнельозної інфекції.

8. Вперше виділено і вивчено структуру та властивості ЛПЦ штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica. Зразки ЛПЦ цих ентеробактерій характеризуються більш низьким рівнем токсичності у порівнянні із зразками комерційних ЛПЦ E. coli О55:В5, та співставимі за рівнем пірогенності із лікарським препаратом “Пірогенал”. Отримані результати дослідження ЛПЦ рахнел, прагій, будвіцій обґрунтовують перспективність подальших наукових розробок в напрямку практичного застосування корисних ефектів ЛПЦ в медичній сфері.

9. Вперше встановлено, що за своїми фізіологічними та біохімічним властивостям значна частка штамів рахнел, прагій та будвіцій відповідає характеристикам таких основних груп санітарно-показових мікроорганізмів як БГКП і ЛКБ (за виключенням випадку співвідношення між P. fontium і ЛКБ), але – не ТКБ. Тому, при расшифруванні характеру мікробної контамінації води, виявлення в ній ентеробактерій видів R. aquatilis, P. fontium та B. aquatica недоцільно розглядати як її забруднення виділеннями людини і теплокровних тварин.

10. На основі результатів комплексно обстеження хворих на ГКІ, клінічно здорових людей та аналізу літературних джерел визначено комплекс клінічних, епідеміологічних і мікробіологічних критеріїв для етіологічної діагностики рахнельозної кишкової інфекції. Основними мікробіологічними критеріями є: негативні результати лабораторних досліджень щодо виявлення відомих патогенів - збудників ГКІ; виявлення у випорожненнях хворого рахнел у концентрації 10⁶ і більше КУО/г; наростання в 4 і більше разів титрів рахнельозних антитіл в динаміці перебігу кишкової інфекції; виявлення в об’ємній РА з автоштамом R. aquatilis специфічних О-аглютинінів в титрі 1:20 і вище, Н-аглютинінів в титрі 1:100 і вище.

11. Розроблено метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis, в тому числі способи внутрішньовидового фено- (визначення ферментоварів, антибіотикорезистенсварів) і генотипування (визначення ПП, АПДФР ХрДНК) штамів збудника. Метод мікробіологічної діагностики рахнельозів базується на проведенні бактеріологічного дослідження з дотриманням основних етапів уніфікованої схеми лабораторного аналізу клінічного матеріалу для виявлення та ідентифікації ентеробактерій - збудників інфекційних захворювань у відповідності із чинними нормативно-методичними документами якими регламентується діяльність бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних та санітарно-гігієнічних закладів охорони здоров’я України.

Публікації автора:

У фахових виданнях, затверджених ВАК України:

(* - особистий внесок здобувача)

1. Похил С.И. Новые для медицины виды энтеробактерий / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. – 1996. – Т.58, №3. – С. 94-103.

2. Похил С.И. Редко встречающиеся, атипичные и новые виды энтеробактерий / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. – 1996. – Т.58, №4. – С. 93-109.

3. Похил С.И. Биологические свойства штаммов Rahnella aquatilis, изолированных в разных регионах / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. - 1998. – Т.60, № 3. – С. 31-36.

4. Похил С.И. Биологические свойства адсорбированной и неадсорбированной ОН-агглютинирующих сывороток для идентификации бактерий Rahnella aquatilis / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. – 1997. – Т.59, №1. – С. 70-76.

5. Похил С.І. Властивості бактерій Pragia fontium, ізольованих на території України і Чехії / С.І. Похил // Мікробіологічний журнал. - 2000. –Т.62, № 2. – С. 3-10.

6. Microbiological characteristics of Rahnella aquatilis strains isolated from patients with diarrhea / S.I Pokhil. // Вісник Сумського державного университету. Серія: Медицина. – 2001. – Т.32, №11. – С. 132-137.

7. Похил С.И. Бактериологическая диагностика заболеваний, вызванных Rahnella aquatilis / С.И. Похил // Клиническая лабораторная диагностика. – 1997. – №8. – С. 44-47.

8. Похил С.І. Вивчення осередків життєдіяльності бактерій Budvicia aquatica на території України. Біологічні властивості штамів бактерій B. aquatica, ізольованих в Україні та Чехії / С.І. Похил // Анали Мечниківського Інституту. – 2002. – №2-3. – С. 20-26.

9. Похил С.І. Патогенний потенціал Rahnella aquatilis: дослідження факторів патогенності, які відповідають за здатність рахнел колонізувати тропні тканини організму господаря [Електронний ресурс] / С.І. Похил // Анали Мечниківського Інституту. –2007. – №2. – С. 11-18. – Режим доступу до журн. : www.hniimi.da.ru/journal.

10. Похил С.И. Способ приготовления препаратов для электронномикроскопического исследования фимбриальных структур бактерий / С.И. Похил, М.В. Смелянская // Клиническая лабораторная диагностика. – 1993. – №5. –С. 22-24. (* - розробив удосконалений спосіб приготування препаратів для електронно-мікроскопічних досліджень фімбрій, проаналізував результати і підготував статтю до публікації).

11. Похил С.І. Біологічні властивості та медичне значення бактерій Rahnella aquatilis / С.І. Похил, І.В. Корнієнко, С.В. Похил // Вестник проблем биологии и медицины. - 1996. – Вып.4. – С. 129-140. (* - виконав експериментальні дослідження, проаналізував результати та підготував статтю до публікації).

12. Похил С.І. Критерії етіологічної діагностики кишкових інфекцій, викликаних рагнелами / С.І. Похил, Н.П. Макій // Інфекційні хвороби. – 1997. – №3. – С. 10-13. (* - виконав експериментальні дослідження, проаналізував результати та підготував статтю до публікації).

13. Похил С.И. Применение прибора “Пульс-ГЭФ1“ для проведения гель-элекктрофореза в пульсирующем поле / С.И. Похил, Р.П. Савин // Український журнал медичної техніки і технології. –1997. – №3-4. – С. 71-75. (* - провів випробування експериментального зразка приладу, проаналізував і узагальнив результати досліджень, підготував статтю до публікації).

14. Тимченко Е.Н. Анализ рестрикционного картирования ДНК как метод современного типирования возбудителей инфекционных заболеваний / Е.Н.Тимченко, Ю.Л. Волянский, С.И. Похил // Вестник проблем биологии и медицины. -1997. – Вып.32. – С. 129-140. (* - проаналізував і узагальнив дані літератури, уніфікував метод аналізу поліморфізма довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК).

15. Похил С.И. Определение обьема (веса) инокулята, наносимого с использованием репликатора Семенихиной / С.И. Похил, В.В. Красовский, Е.Н. Тимченко // Клиническая лабораторная диагностика. – 1998. – №7. – С. 34-36. (* - виготовив реплікатори із різним діаметром голок, виконав експериментальні дослідження та підготував статтю до публікації).

16. Цыганенко А.Я. Рестрикционное картирование ДНК – как современный метод классификации бактерій / А.Я. Цыганенко, Е.Н. Тимченко, С.И. Похил // Вестник проблем биологии и медицины. - 1998. –Вып.2. – С. 16-26. (* - проаналізував і узагальнив дані літератури з цієї проблеми, підготував статтю до публікації).

17. Идентификация видов семейства Enterobacteriaceae, образующих сероводород / С.И. Похил, С.А. Деркач, Т.В. Пивненко, Т.В. Перцхалава // Мікробіологічний журнал. - 1998. – Т.60, № 4. – С. 3-14. (* - приймав участь в експериментальних дослідженнях, розробив таблиці диференціації ентеробактерій які утворюють сірководень, підготував статтю до публікації).

18. Ферменты патогенності клинических штамов Klebsiella pneumoniae / О.В. Агапова, В.М. Бондаренко, Н.А. Поликарпов [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1999. – №2. – С. 5-8. (* - виділив та ідентифікував штами клебсієл, приймав участь в удосконаленні методів визначення факторів патогенності у ентеробактерій, в аналізі результатів досліджень).

19. Циганенко А.Я. Завдання і шляхи удосконалення генотипування збудників інфекційних захворювань методом аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК / А.Я. Циганенко, С.І. Похил, О.М. Тимченко // Експериментальна і клінічна медицина. – 2002. – №3. – С. 79-83. (* - проаналізував дані літературних джерел, обґрунтував напрямки удосконалення внутрішньовидового генотипування штамів бактерій методом аналізу поліморфізма довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК, підготував статтю до публікації).

20. Марющенко А.М. Исследование чувствительности возбудителя рахнельозной инфекции к антибактериальным препаратам / А.М. Марющенко, Н.П. Волянська, С.И. Похил // Експериментальна і клінічна медицина. –2002. –№3. –С. 83-87. (* - виконав експериментальні дослідження, провів статистичну обробку результатів та підготував статтю до публікації).

21. Рахнеллезы – сапрофитные бактериальные зоонозы / Козько В.Н., Похил С.И., Бондаренко А.В., Бондаренко В.М. // Сучасні інфекції. –2003. –№4. – С100-104. (* - провів підбір і аналіз даних літературних джерел, надав результати своїх досліджень для підготовки статті до публікації).

22. Варбанец Л.Д. Характеристика структурных компонентов липополисахаридов Rahnella aquatilis / Л.Д. Варбанец,А.Н. Остапчук, С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. -2004. – Т.66, № 4. – С. 13-21. (* - виділив та ідентифікував штами рахнел, вивчив їх біологічні властивості, надав консультативну допомогу щодо методів нарощування бактерійної маси для приготування препаратів ацетонових порошків, із яких в подальшому були отримані зразки ЛПЦ).

23. Тимченко О.М. Порівняльна характеристика методів руйнування клітин мікроорганізмів для отримання інтактних форм плазмідної та хромосомної ДНК [Електронний ресурс] / О.М. Тимченко, Похил С.І. // Анали Мечниківського Інституту. –2005. –№2. –С. 82-91. – Режим доступу до журналу: www.hniimi.da.ru/journal. (* - приймав участь в експериментальних дослідженнях, удосконалив технологію проведення швидкого міні-лізису бактерійних клітин, підготував статтю до публікації).

24. Варбанец Л.Д. Характеристика эндотоксического липополисахарида Pragia fontium DRL 27480 / Л.Д. Варбанец, В.В. Шубчинский, С.И. Похил // Современнные проблемы токсикологии. – 2006. – №2. – С. 66-71. (* - виділив та ідентифікував штами прагій, вивчив їх біологічні властивості, надав консультативну допомогу щодо методів нарощування бактерійної маси для приготування препаратів ацетонових порошків із яких в подальшому були отримані зразки ЛПЦ).

У інших наукових виданнях:

25. Цыганенко А.Я. Методы классификации бактерий: современное состояние проблемы / А.Я. Цыганенко, С.И. Похил // Вестник проблем современной медицины. – 1995. – Вып.9. –С. 15-24.

26. Методика виділення, ідентифікації та довгострокового зберігання чистих культур Rahnella aquatilis / Похил С.І., Осолодченко Т.П., Волянська Н.П. [та ін.] // Методи одержання чистих культур мікроорганізмів та їх довгострокового зберігання в колекціях: Роботи співробітників Музею патогенних для людини мікроорганізмів. –К.: Знання України, 2000. – Вип. 1. –С. 66-80..

27. Циганенко А.Я. Час для зміни догм. Сучасна теорія і практика відкриття нових збудників інфекційних захворювань (огляд): навч. посіб. [для науковців та студ. мед. вищ. навч. зал.] / Циганенко А.Я., Мінухін В.В., Похил С.І. – Х.: ХДМУ, 2006. – 35 с. – (Затверджено вченою радою ХДМУ МОЗ України від 2005-03-17, протокол №3).

28. Сучасна теорія і практика відкриття нових збудників інфекційних захворювань (огляд): навч. посіб. [для науковців та студ. мед. вищ. навч. зал.] /

[Циганенко А.Я., Кратенко І.С., Мінухін В.В. та ін.]. – Х. : Фоліо, 2007. –55 с. - (Затверджено учбово-методичною радою ХМАПО МОЗ України від 2006-12-11, протокол №10).

29. Каталог культур: Бактерії. Мікоплазми. Хламідії. Дріжджоподібні гриби. Культури клітин / [авт.-уклад. Сельникова О.П. та ін.] –К.: Знання України, 2000. – 119 с.

30. Мікробіологічна діагностика рахнельозів (захворювань, спричинених Rahnella aquatilis). - [Чинні від 1997-08-12]. –Х. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 1997. - (Методичні рекомендації МОЗ України).– 22 с.

31. Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій. - [Чинні від 1999-12-09]. –Х. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 2000. – (Методичні рекомендації МОЗ України). – 52 с.

32. Епідеміологічне, внутрішньовидове генотипування ентеробактерій – збудників інфекційних захворювань. - [Чинні від 2003-11-11]. – Х. : МОЗ України, АМН України, УкрЦНМІПЛР, 2003. – 43 с. – (Методичні рекомендації МОЗ України).

33. Нова методика диференціації збудника рахнельозів від споріднених ентеробактерій. – [Чинне від 1998-04-06].. – К. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 1999. - Вип. 8-9, №129/9/8. - С. 74-75. - (Реєстр галузевих нововведень МОЗ України. Нововведення).

34. Технологія визначення плазмідного профілю у культур бактерій – сучасний метод епідеміологічного типування збудників гострих кишкових інфекцій (ГКІ). – [Чинне від 2000-06-20]. – К. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 2000. - Вип. 12-13, №118/13/00. - С. 62-63. - (Реєстр галузевих нововведень МОЗ України. Нововведення).

35. Спосіб епідеміологічного (внутрішньовидового) генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК. – [Чинне від 2002-07-04]. –К. : АМН України, 2002. – Вип. 15. –С. 30. – (Інформаційний бюлетень АМН України. Нововведення).

36. Волянский Ю.Л. Изучение новых видов энтеробактерий – возбудителей оппортунистических инфекционных заболеваний / Ю.Л. Волянский, С.И. Похил // Организация научных исследований и высшего образования в Израиле и Украине: материалы медицинской секциии международного семинара, (Харьков, 16-18 октября 1994 г.). – М-во наук и искусств Израиля, Харьк. гос. ун-т [и др.]. – Х. : Международное общество ”Украина-Израиль“, 1994. – С. 34.

37. Похил С.І. Rahnella aquatilis – новий патоген родини Enterobacteriaceae / С.І. Похил // Актуальні проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та профілактики інфекційних хвороб: матеріали XIII з’їзду Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів імені Д.К. Заболотного, (Вінниця, 9-11 жовтня 1996 р.). – М-во охорони здоров’я, Укр. наук. тов. мікробіол., епідеміол. та паразитол. ім. Д.К. Заболотного [та ін.]. - Київ-Вінниця, 1996. –С. 286-287.

38. Шаповал В.Ф., Похил С.І. Дослідження нових збудників гострих кишкових інфекцій в Полтавській області та інших регіонах України / В.Ф. Шаповал, С.І. Похил // Матеріали ювілейної науково-практичної конференції Полтавської обласної СЕС, присвяченої 80-річчю Державної санітарно-гігієнічної служби України. – М-во охорони здоров’я, Полт. обл. санепідстанція [та ін.]. –Полтава, 2003. –С.205.