Анотація до роботи:

Антіпов І.О. Біотехнологічні аспекти молекулярної діагостики латентної вірусної інфекції картоплі (Solanum tuberosum L.). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Національний аграрний університет, Київ, 2008.

Дисертація присвячена дослідженню українських ізолятів Х-, Y-, M-, і
S- вірусів картоплі, з’ясуванню їх філогенетичної природи й біотехнологічних аспектів контролю латентної вірусної інфекції при вирощуванні та оздоровленні картоплі.

Вперше в Україні створено і впроваджено в практику фітосанітарного контролю діагностичні тест-системи для виявлення та кількісного визначення латентних вірусних інфекцій (українських ізолятів Х-, Y-, M-, S- вірусів картоплі) у посадковому матеріалі картоплі на основі ПЛР та ПЛР у реальному часі.

Проведено кількісне визначення ідентифікованих вірусних патогенів у безсимптомному посадковому матеріалі (бульбах) картоплі. Визначено часткові нуклеотидні послідовності генів капсидних білків українських ізолятів Х-, Y-, M-, S- вірусів картоплі, які депоновано в генетичний банк даних під номерами – PVX, – PVY та – PVM. Доведено, що українські ізоляти Х-, Y-, M- й S- вірусів картоплі займають окремий кластер у філогенетичному древі геномів досліджуваних вірусів.

Отримані результати дозволяють прослідкувати динаміку розповсюдження та накопичення вірусних інфекцій при отриманні посадкового матеріалу картоплі та при вирощуванні в агроценозах.

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється в розробці біотехнологічних прийомів молекулярно-біологічного контролю вірусної інфекції в латентний період при оздоровленні та вирощуванні картоплі.

1. Здійснено скринінг 18 зразків сортів картоплі методами електронної мікроскопії та імуноферментного аналізу на предмет інфікування Х-, Y-, M-, S-, й L-вірусами картоплі та відібрано позитивні зразки для розробки молекулярно-біологічних діагностикумів.

2. Проведено дизайн та синтез молекулярних праймерів для ПЛР діагностикумів вірусів картоплі з утворенням ПЛР ампліконів розміром: ХВК – 411 п.н., YВК – 365 п.н., МВК – 276 п.н., SВК – 213 п.н..

3. Оптимізовано умови полімеразної ланцюгової реакції і ПЛР у реальному часі. Встановлено, що оптимальна концентрація іонів Mg²⁺ у реакційній суміші становить 1,5 мМ, температура відпалу праймерів 60 ⁰С.

4. Визначено часткові нуклеотидні послідовності генів білків оболонки українських ізолятів Х-, Y-, M- і S-вірусів картоплі, які депоновано в генетичний банк даних під номерами – PVX, – PVY та – PVM.

5. Здійснено філогенетичний аналіз українських ізолятів Х-, Y-, M- і S-вірусів картоплі, який підтвердив окреме їх генетичне положення.

6. Проведено порівняльну оцінку нуклеотидних послідовностей українських ізолятів з нуклеотидними послідовностями відомих ізолятів Х-, Y-, M- і S-вірусів картоплі. З’ясовано, що 97% гомології український ізолят ХВК виявляв з ізолятами локалізованими у Єгипті, Китаї і Аргентині, 100 – український ізолят YВК з ізолятом локалізованим у США, 97 - український ізолят MВК з ізолятами локалізованими у Німеччині, Росії й Італії, 95% – український ізолят SВК з ізолятами локалізованими у Німеччині, Китаї та Великобританії.

7. Вперше в Україні розроблено ПЛР тест-системи для виявлення Х-, Y-, M- та S-вірусів картоплі. Створено діагностичні тест-системи на основі ПЛР у реальному часі для виявлення та кількісного визначення українських ізолятів Х- Y- M- та S-вірусів картоплі.

8. Розроблено біотехнологію конструювання плазмідного стандарту, яка дозволяє визначати кількісне навантаження геномів українських ізолятів ХВК, YВК, MВК і SВК у зразках картоплі методом ПЛР у реальному часі.

9. Підтверджено ефективність проведення молекулярно біологічного контролю на вірусоносійство при in vitro оздоровленні картоплі.

Рекомендації виробництву

Для запобігання розповсюдження вірусів картоплі ХВК, YВК, MВК і SВК, підвищення чутливості діагностики вірусних хвороб у латентний період і прискорення процесу виробництва посадкового матеріалу картоплі in vitro вільного від патогенів вірусної природи рекомендовано проводити комплексну діагностику посадкового матеріалу на вірусоносійство з використанням діагностичних тест-систем на основі ПЛР та ПЛР у реальному часі.

Розроблені тест-системи апробовано на базі НДГ «Великоснітинське» ім. О.В. Музиченка і УЛЯБП АПК НАУ і рекомендовано Укрголовдержкарантину і Держсортослужбі України для використання при проведенні державної реєстрації нових сортів, здійснені експорту та імпорту насіннєвого матеріалу картоплі.

Публікації автора:

1. Мельничук М.Д., Aнтіпов І.О., Спиридонов В.Г., Мельничук С.Д. Розробка діагностичних тест-систем на виявлення вірусів картопляної групи методом полімеразної ланцюгової реакції // Аграрна наука і освіта. – 2005. – Т. 6, № 1–2. –

С. 5–8 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

2. Антiпов І.О., Гордєйчик О.І., Мельничук М.Д., Міщенко Л.Т., Спиридонов В.Г., Таран О.П. Перебіг вірусної інфекції в рослинах картоплі за дії модельованої мікрогравітації // Мікробіол. журн. – 2007. – Т. 69, №4. – С. 63–68 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

3. Антіпов І.О., Спиридонов В.Г., Мельничук М.Д. Розробка діагностичних ПЛР систем у реальному часі для виявлення українських ізолятів Х-, Y-, M-, та S- вірусів картоплі // Наукові доповіді НАУ. – 2007. – №3 (8). - Режим доступу до журн.: (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

4. Антіпов І.О., Спиридонов В.Г., Мельничук М.Д. Філогенетичний аналіз генів капсидних білків українських ізолятів вірусів картоплі // Науковий вісник Ужгородського університету. – Серія: Біологія. – 2007. – Вип. 20. – С. 220–225 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

5. Мельничук М.Д., Антіпов І.О. Розробка діагностичних тест-систем на виявлення вірусів картопляної групи методом полімеразної ланцюгової реакції // Молодь і поступ біології: Тези доповідей Першої Міжнародної конференції студентів та аспірантів. Львів, 11-14 квітня 2005 р. – Львів: СПОЛОМ, 2005. – С. 153 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

6. Антипов И.А., Спиридонов В.Г., Облап Р.В., Мельничук М.Д. Количественный анализ латентных вирусов картофельной группы (PVX, PVY, PVM, PVS) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени // Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология и перспективы развития». Москва,
12-16 марта 2007 г. – Москва: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. – С. 253 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

7. Антіпов І.О., Спиридонов В.Г., Мельничук М.Д. Діагностика латентної вірусної інфекції (PVX, PVY, PVM, PVS) в посадковому матеріалі картоплі (Solanum tuberosum L.) // Тези V Міжнародної конференції «Біоресурси та віруси». Київ,
10-13 вересня 2007 р. – Київ: Фітосоціоцентр, 2007. – С. 163 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень, підготовку матеріалу до друку).

8. Patyka M., Spyrydonov V., Antipov I. The cloning of capsid protein genes of potato viruses (PVX, PVY, PVM, PVS) // Postgraduate Course "Applied and fundamental aspects of responses, signaling and developmental process in the root-microbe systems". St.-Petersburg, Russia, June 25-July 2, 2007. – Р. 61 (здобувач провів експеримент, обробку результатів досліджень).