Журавель Олена Валентинівна. Функціональний аналіз бета-дефенсину-2 в злоякісно трансформованих клітинах : Дис... канд. наук: 14.01.07 - 2009.
Анотація до роботи:
Журавель О.В. Функціональний аналіз бета-дефенсину-2 в злоякісно трансформованих клітинах. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 – онкологія. Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ – 2009.
Дисертація присвячена дослідженню функціональної ролі бета-дефенсину-2 в пухлинних клітинах.
Шляхом трансфекції плазмідними векторами, що містять кДНК гена повної та процесованої форми бета-дефенсину-2, на основі ліній HEK293 (ембріональної нирки людини) та 3LL (карциноми легені Л’юїс миші) було створено клітинні модельні системи з різним рівнем експресії бета-дефенсину-2.
В експериментальних дослідженнях in vitro, проведених на трансфікованих сублініях, створених на основі лінії HEK293, показано, що підвищення рівня експресії hBD-2 та його внутрішньоклітинне накопичення призводить до втрати клоногенної активності клітин та зниження їх проліферативних показників більш як в 3 рази. Одночасно спостерігали зниження фосфорилювання рибосомного S6 білка – одного з ключових компонентів, причетних до білкового синтезу.
На модельних системах, створених на основі лінії 3LL, було продемонстровано, що зниження рівня експресії мРНК mBD-2 викликає підвищення здатності клітин до колонієутворення та зростання їх проліферативної активності.
В дослідах in vivo на експериментальних пухлинах, отриманих з клітин 3LL з різним рівнем експресії мРНК mBD-2, встановлено зворотню кореляцію між експресією дефенсину і швидкістю росту пухлин. В пухлинах, як і в клітинних лініях, спостерігали пригнічення експресії mBD-2.
В роботі визначено функцію бета-дефенсину-2 як потенційного супресора росту пухлинних клітин in vitro та in vivo.
1. З використанням генно-інженерних технологій на основі лінії клітин ембріональної нирки людини НЕК293 були створені клітинні лінії HEKhBD-2Mat та HEKhBD-2Pr, які експресують несекреторну та секреторну форми hBD-2, відповідно.
2. Встановлено, що експресія hBD-2 в клітинній сублінії HEKhBD-2Pr призводить до зниження показників колонієутворення в порівнянні з відповідними показниками в клітинах вихідної лінії, а в клітинах HEKhBD-2Mat – до достовірного зниження синтезу ДНК, пригнічення фосфорилювання рибосомного S6 білка, а також до втрати клоногенної активності клітин у напіврідкому середовищі.
3. На основі лінії клітин карциноми легені Л’юїс (3LL) створено трансфіковані клітинні лінії 3LLmBD-2 та 3LLIgkmBD-2, які експресують процесовану та непроцесовану форми гена mBD-2.
4. Показано, що в трансфікованих клітинних лініях 3LLmBD-2 та 3LLIgkmBD-2 рівень експресії мРНК дефенсину знижений у порівнянні з клітинами дикого типу, для яких характерна конститутивна експресія гена mBD-2.
5. Встановлено, що пригнічення експресії мРНК mBD-2 в клітинних сублініях 3LLmBD-2 і 3LLIgkmBD-2 призводить до підвищення показників колонієутворення та проліферації у порівнянні з контрольними клітинами в моделі in vitro.
6. Продемонстровано, що експериментальні пухлини, отримані з трансфікованих клітин миші – 3LLmBD-2 і 3LLIgkmBD-2 – характеризуються достовірно більш високою швидкістю росту, ніж пухлини контрольних штамів.
Публікації автора:
Expression patterns of murine beta-defensin-2 mRNA in Lewis lung carcinoma cells in vitro and in vivo / E. Zhuravel, T.Shestakova, N.Glushko, M.Soldatkina, P.Pogrebnoy // Exp.Oncology – 2008. – Vol. 30, № 3. – P. 206 – 211. (Особистий внесок здобувача: дизайн праймерів та клонування секреторної та несекреторної форми mBD-2 у вектори pcDNA3, pGex2T, pSecTag2a, трансфекція та створення клітинних ліній з різним рівнем експресії mBD-2 на основі лінії 3LL, дослідження рівня експресії дефенсина в отриманих клітинних лініях, та при його екзогенній дії, аналіз проліферативних показників, статистична обробка отриманих результатів, участь у написанні статті та інтерпретації результатів).
Regulated expression of human beta-defensin-2 leads to altered phenotype and growth patterns of cultured human embrional kidney cells/ E. Zhuravel, D. Lytvyn, M. Soldatkina, S. Zeleniy, T. Shestakova, P. Pogrebnoy. // Exp. Oncology – 2006. – Vol. 28, No. 4. – P. 288 – 392. (Особистий внесок здобувача: дизайн праймерів та клонування генів повної та зрілої форм hBD-2, трансфекція клітин, участь у створенні клітинних ліній, експресуючих hBD-2, експерименти з отриманими клітинними лініями, статистичні розрахунки, участь в аналізі результатів та написанні статті).
Involvment human beta-defensin-2 in intracellular signaling: in vitro study / D. Lytvyn, E. Zhuravel, N. Markeeva, M. Soldatkina, T. Dudchenko, P. Pogrebnoy // Exp. Oncology – 2006. – Vol. 28, No. 3. – P.198 – 202. (Особисий внесок здобувача: дизайн праймерів до генів бета-актину, G3PDH та дефенсину, дослідження експресії hBD-2 та p70S6 методом ЗТ-ПЛР в клітинах лінії A431).
Involvment of human beta-defensin-2 in proliferation of transformed cells of human cervix / N. Markeeva, L.Lisovskiy, E. Zhuravel, M. Soldatkina, V. Lizogubov, V. Usenko, P.Pogrebnoy // Exp. Oncology – 2005. – Vol. 27, No 4. – P. 308 – 313. (Особистий внесок здобувача: дослідження проліферативної активності клітин A431, інкубованих в присутності hBD-2, участь в аналізі результатів та написанні статті).
Soldatkina M. Human defensins – multifunctional peptide antibiotics / M. Soldatkina, E. Zhuravel, P.Pogrebnoy // Scientific program and abstracts of international conference “Tumor hypoxia and malignant progression”, 1 – 4 жовтня, 2008, Київ, Україна, С. 22.
Zhuravel Е. The development of the system for the use of murine beta-defensin-2 as a component of anticancer vaccines in vivo / Е. Zhuravel, М. Soldatkina, P. Pogrebnoy // VIII Міжнародна конференція молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології”, Тез. доп., 26-27 квітня 2007. – Україна, Київ, С.92.
Expression of beta-defensin-2(hBD-2) and isoforms of p70S6 kinase in human endometrial tumors / Zhuravel E.V., Lytvyn D.I., Soldatkina M.A., Gurtovyy V.A., Lactionov P.P., Pogrebnoy P.V. // International conference Basic Science for Biotechnology and Medicine. - 3-7 september 2006. - Russia, Novosibirsk, Р.96.
Журавель Е.В. Клонирование и экспрессия бета-дефенсина-2 (hBD-2) в тетрациклин-регулируемой системе системе экспрессии для клеток млекопитающих (T-Rex system) / Е.В. Журавель, В.В. Лизогубов, П.П. Погребной // VII Міжнародна конференція молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології”, Тез. доп., 2-3 лютого 2006. – Україна, Київ, С.34.
Zhuravel E.V. Cloning and expressin of beta-defensin-2 (hBD-2) in tetracycline-regulated expression system/ E.V. Zhuravel, P.V. Pogrebnoy // Матеріали IX Українського біохімічного з`їзду, 24-27 жов. 2006 р.: - Харків, 2006. – С.185.
