Анотація до роботи:

Дубін О.В. Генетична диференціація геномів за маркерами ISSR-PCR та RAPD-PCR. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. – Інститут розведення і генетики тварин УААН, с. Чубинське, Київської обл., 2009.

Дисертаційну роботу присвячено вивченню інформативності двох типів молекулярно-генетичних маркерів (ISSR- та RAPD-PCR) для диференціації геномів тварин і рослин на прикладі трьох видів підродини бичачих, сортів культурної та популяцій дикої сої.

Розроблено загальний алгоритм оптимізації методів мультилокусного ДНК-профілювання та запропоновано методику стандартизації протоколів виділення геномної ДНК. Визначено оптимальні діапазони концентрацій реагентів реакційної суміші та умов проведення ISSR- та RAPD-PCR.

За даними поліморфних спектрів ISSR- та RAPD-PCR визначено показники генетичної мінливості та популяційної різноманітності зубра, бізона та сірої української породи великої рогатої худоби. Виконано порівняльний аналіз інформативності ISSR- та RAPD-методів для міжвидової диференціації тварин.

Досліджено молекулярно-генетичний поліморфізм 5 популяцій дикої уссурійської та 14 сортів культурної сої за допомогою ISSR- та RAPD-методів. Визначено генетичні взаємовідносини між генотипами сої на основі отриманих спектрів ампліфікації та розраховано відповідні генетичні дистанції. За використання поліморфних локусів п’яти RAPD- та трьох ISSR-праймерів розроблено методику генетичної паспортизації сортів сої.

Виконано порівняння дискримінаційного потенціалу використаних у роботі ПЛР-методів для дослідження геномів рослин і тварин.

1. На прикладі представників підродини Bovinae та підродини Phaseoleae теоретично обґрунтовано і практично доведено високу інформативність ISSR- та RAPD-маркерів для генетичної диференціації геномів вищих організмів, а також можливість їхнього використання для генетичної паспортизації.

2. Найважливішим етапом екстракції ДНК, що впливає на якісні та кількісні характеристики препарату ДНК, є початковий лізис біологічного матеріалу. Додаткове очищення препарату ДНК методом сорбції на силіцій оксиді уможливлює отримання чітких та відтворюваних спектрів ампліфікації ISSR- та RAPD-PCR.

3. Оптимальними умовами проведення полімеразної ланцюгової реакції за використання досліджених у роботі 22 ISSR- та 9 RAPD-праймерів є наступні: концентрація геномної ДНК – 30–60 нг; іонів Mg²⁺ – 1,8–2,2мМ; dNTP – 200 мкМ; Taq-полімерази – 0,8–1,2 од.; ISSR-праймерів – 0,3–0,6 мкМ; RAPD-праймерів – 0,4–0,7 мкМ; кількість циклів – 32 для ISSR-PCR та 35–37 для RAPD-PCR; температура відпалу – 52–58С та 45С відповідно.

4. Одомашнений (Bos taurus) і дикі види тварин підродини бичачих (Bison bison, Bison bonasus), а також сорти культурної (Glycine max L.) та популяції дикої уссурійської сої (Glycine soja) характеризуються високим і порівнянним рівнем генетичної мінливості за маркерами ISSR- та RAPD-PCR. Так, середня гетерозиготність сірої української породи за маркерами ISSR- та RAPD-PCR становила відповідно 0,278 та 0,213, бізона – 0,274 та 0,221, зубра – 0,177 та 0,169. Аналогічні показники для дикої та культурної сої становили відповідно 0,357 та 0,345 і 0,411 та 0,406.

5. Залежно від типу маркерів та нуклеотидної послідовності праймерів, оцінка генетичної спорідненості трьох видів – зубрів, бізонів та великої рогатої худоби – може бути різною. Відтак у випадку ДНК-аналізу необхідна індивідуальна оцінка інформативності та ефективності використання окремих маркерів для виконання міжвидових порівнянь.

6. Поліморфні системи маркерів ISSR- та RAPD-PCR дають змогу проводити генетичну паспортизацію. Так, для ідентифікації 14 сортів сої різного еколого-географічного походження достатнім було застосувати 5 RAPD-праймерів (UBC-1, UBC-2, UBC-3, UBC-6, UBC-9) або 3 ISSR-праймери ((AGC)₆G, (CTC)₆A, (AC)₉C).

7. Серед досліджених 9 RAPD- та 22 ISSR-праймерів найбільш інформативними для генетичної диференціації геномів виявлено ISSR-маркери з тринуклеотидними мікросателітними повторами. Середня кількість і частка поліморфних локусів за цими маркерами у сірої української породи великої рогатої худоби становила відповідно 16,6 та 12,4, у сортів сої – відповідно 22,8 та 10,2.

Публікації автора:

1. Полиморфизм белков, RAPD-PCR и ISSR-PCR маркеров у зубров, бизонов и крупного рогатого скота / В.И. Глазко, Т.Н. Дымань, С.И. Тарасюк, А.В. Дубин // Цитология и генетика. – 1999. – Т. 33, № 6. – С. 30–39. (Дисертант брав участь у проведенні експерименту, аналізі матеріалу, написанні статті).

2. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR-маркеров / В.И. Глазко, А.В. Дубин, Р.И. Календарь, Г.В. Глазко // Цитология и генетика. – 1999. – Т. 33, № 5. – С. 47–51. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, взяв участь у написанні статті).

3. Дубін О.В. Тестування умов проведення ISSR-PCR та їх оптимізація для аналізу геному сої (Glycine max) / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. – Біла Церква, 2007. – Вип.46. – С.49–54. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написав статтю).

4. Дубін О.В. Генетична паспортизація сортів сої (Glycine max) за допомогою RAPD-PCR / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні Вісті. – 2007. – №.1. – С.12–15. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).

5. Дубін О.В. Інформативність маркерів ISSR-PCR у дослідженні геномів рослин і тварин / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні вісті. – 2008. – №2. – С.7–9. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).

6. Дубін О.В. Поліморфізм маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR у деяких представників підродини бичачих / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківського національного аграрного університету. – 2008. – Вип.53. – С.43–48. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).

7. Глазко В.И. Полиморфизм ISSR у некоторых сортов сои / В.И. Глазко,
   А.В. Дубин, Г.В. Глазко, Р.И Календарь // Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва: міжнар. конф.: тези доп. – Харків, 1999. – С. 139–141.

8. Дубин А.В. ISSR-маркеры в анализе генетических взаимоотношений между сортами домашней сои и популяциями дикой сои / А.В. Дубин, В.И. Глазко // Землеробство ХХІ століття – проблеми та шляхи вирішення: міжнарод. наук.-практ. конф., 8–10.06.1999: тези доп. – Київ–Чабани, 1999.– С.184–185.

9. Дубін О.В. Молекулярно-генетичний поліморфізм та паспортизація сортів культурної сої за використання RAPD-PCR та ISSR-PCR / О.В. Дубін // Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті: IV держ. наук.-практ. конф., 16–17.05.2007: тези доп. – Біла Церква, 2007. – С.26.

10. Дубін О.В. Оптимізація умов проведення ISSR-PCR та RAPD-PCR для аналізу геномів рослин та тварин / О.В. Дубін // Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті: міжн. наук.-практ. конф., 15–16.05.2008: тези доп. – Біла Церква, 2008. – С.64.