Анотація до роботи:

Федоренко В.О. Генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його роль у біосинтезі антибіотиків. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.15.- генетика. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004.

У дисертації вивчено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp.caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. У досліджених штамів відбуваються спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності до антибіотиків. Показано, що мутанти Sacch. erythraea, стійкі до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину, мутанти S. peucetius subsp.сaesius, стійкі до даунорубіцину та доксорубіцину, а також мутанти S. kanamyceticus, стійкі до аміноглікозидів, перспективні для селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. З бібліотеки генома продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та секвеновано кластер генів біосинтезу цього антибіотика. У ньому виявлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28 з них. Ідентифіковано п’ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину в S. kanamyceticus. Клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує метилазу 16S рРНК та зумовлює стійкість S. kanamyceticus до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Опрацьовано системи клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus за допомогою кон’югаційного перенесення плазмід з E. coli та розоблено генетичні та генно-інженерні підходи до створення штамів, які здатні до підвищеного синтезу еритроміцину, ефективної трансформації даунорубіцину в доксорубіцин та продукції нових ландоміцинів H, F та G.

У результаті виконаної роботи встановлено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вивчено вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp.caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. Обґрунтовано перспективність використання мутацій, що змінюють стійкість актиноміцетів до антибіотиків у селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. Показано, що ознаки природної стійкості до антибіотиків можуть розглядатися як модельні для вивчення генетичної нестабільності актиноміцетів а їх виявлення та аналіз є необхідною складовою частиною конструювання та селекції цих бактерій. На основі отриманих результатів опрацьовано підходи до селекції високоактивних продуцентів антибіотиків та створено Колекцію культур мікроорганізмів – продуцентів антибіотиків ЛНУ ім.І.Франка, що включена до Державного реєстру об’єктів, що становлять національне надбання.

Головні наукові та практичні результати викладені у таких висновках:

1. Дослідженим штамам актиноміцетів - продуцентам полікетидних антибіотиків та канаміцину властива природна стійкість як до власного, так і інших антибіотиків. Для кожного виду актиноміцетів характерний відмінний спектр множинної антибіотикорезистентності. У різних похідних одного виду, що отримані у результаті селекції на підвищену продукцію антибіотиків, або ж мутантів, що їх не синтезують, а також у морфологічних варіантів одного виду спостерігаються відміни у вияві ознак стійкості як до власного, так і до інших антибіотиків.

2. Охарактеризовано спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності досліджених штамів актиноміцетів до антибіотиків. У геномі нестабільних мутантів S. coelicolor A3(2) та S. ambofaciens виявлено й охарактеризовано послідовності ДНК, здатні до ампліфікації.

3. Отримано та вивчено колекції мутантів продуцента еритроміцину Sacch. erythraea, стійких до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину, мутантів продуцента даунорубіцину та доксорубіцину S. peucetius subsp.сaesius, стійких до власних антибіотиків, а також мутантів S. kanamyceticus, стійких до аміноглікозидних антибіотиків. Кожна з груп мутантів є гетерогенною за рівнем стійкості до вказаних антибіотиків, а у значної їх частини змінені інші ознаки, зокрема, синтез антибіотиків.

4. Створено бібліотеку генома продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та частково секвеновано кластер генів біосинтезу ландоміцину Е. У кластері виявлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28 з них. Гени lndE, lndF, lndA, lndB, lndC, lndD, lndL, lndM, lndN, lndO, lndP, lndV, lndZ4, lndZ6, lndZ5 контролюють синтез полікетидної частини ландоміцину Е, lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1, lndZ3 – синтез дезоксицукрів, lndGT2, lndGT1, lndGT4 – їхнє приєднання до аглікону, ген lndJ є імовірним детермінантом стійкості до ландоміцину Е, а lndI – регулятором структурних lnd-генів.

5. Отримано і досліджено колекцію мутантів S. kanamyceticus, в яких порушені різні етапи біосинтезу канаміцину та ідентифіковано п’ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину (kanA, kanB, kanC, kanD та kanG). Вперше продемонстровано генетичну рекомбінацію після злиття протопластів S. kanamyceticus. Показано зчепленість мутацій kanB та kanD з мутаціями стійкості до еритроміцину, гентаміцину та рифампіцину.

6. Із штаму S. kanamyceticus 1 та його мутанта genR10 клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує ймовірну метилазу 16S рРНК та зумовлює стійкість до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Ділянки ДНК, що оточують ген kmrB, виявляють високий рівень гомології з фрагментами сумарної ДНК продуцента неоміцину S. fradiae та продуцента сизоміцину M. zionensis.

7. За допомогою аналізу макрофрагментів із використанням пульс-електрофорезу визначено розміри хромосомної ДНК п’яти штамів S. kanamyceticus - 7715-8217 т.п.н. Перебудови нуклеотидних послідовностей, а також ампліфікації гена kmrB виявлено у геномах нестабільного Kan^- - мутанта kan12 та мутантів genR8 та genR10, стійких до гентаміцину.

8. Створено систему клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus за допомогою кон’югаційного перенесення плазмід з E. coli. Показано ефективність розробленої системи для спрямованої інактивації lnd-генів S. globisporus.

9. Доведено, що отримання Rif^R-, Cml^R-, Tsr^R- та Str^R-мутантів Sacch. erythraea, Cml^R-мутантів S. ambofaciens, Dnr^R та Dxr^R –мутантів S. peucetius subsp.caesius, Gen^R-мутантів S. kanamyceticus може бути одним з етапів селекції відповідних штамів. Злиття протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують rif-, str- та tsr-мутації є ефективним методом селекції штамів Sacch. erythraea.

10. Показано, що у селекції S. kanamyceticus та S. peucetius subsp.caesius можуть використовуватися мутанти з порушеною глюкозною репресією.

11. Клонування генів dnrI та cpx у S. peucetius subsp.caesius дозволяє виділити штами з підвищеною здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин.

12. Спрямована інактивація гена lndGT4 продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912 зумовлює продукцію нових ландоміцинів F та H, а комплементація генетичних порушень у ньому – синтез ландоміцину G. Нові ландоміцини мають змінені антибактерійні та протипухлинні властивості.

Публікації автора:

1. Федоренко В.А., Стародубцева Л.И., Заворотная С.А., Ломовская Н.В., Даниленко В.Н. Характеристика множественного изменения признаков устойчивости к антибиотикам у Streptomyces coelicolor A3(2) // Генетика.–1989.–Т.25. №4.–С.626-634.

   Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Кириченко Н.В., Даниленко В.Н. Получение и характеристика рифампицин-устойчивых мутантов у Streptomyces erythraeus // Антибиот. и химиотер. – 1990. – Т.35,№12.-С.11-13.

   Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Генетическая нестабильность признака стрептомицин-устойчивости у Streptomyces erythraeus // Антибиот. и химиотер. – 1990. – Т.35,№12.-С.18-21.

   Заворотная С.А., Федоренко В.А.,Стародубцева Л.И., Даниленко В.Н. Амплифицирующаеся последовательности в геноме Streptomyces coelicolor A3(2) // Антибиот. и химиотер. – 1990. – Т.35,№12.-С.21-23.

   Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Кириченко Н.В., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces erythraeus с измененнной устойчивостью к антибиотикам // Труды ВНИИА.-1992.-Вып.21.-С.39-45.

   Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Басилия Л.И., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика генетических рекомбинантов при слиянии протопластов Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. – 1993. – Т.38,№1.-С.24-28.

   Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Басилия Л.И., Захарова Г.М., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Использование слияния протопластов в селекции продуцента эритромицина Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. – 1993. – Т.38,№6.-С.3-8.

   Голец Л.М., Басилия Л.И., Мазепа А.И., Федоренко В.А. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces kanamyceticus с нарушениями биосинтеза канамицина // Антибиот. и химиотер. – 1995. – Т.40,№1.-С.3-7.

   Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Федоренко В.А. Биосинтез канамицина и резистентность к аминогликозидам у мутантов Streptomyces kanamyceticus, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе // Антибиот. и химиотер. – 1996. – Т.41,№6.-С.10-14.

   10. Демидчук Ю.А., Голец Л.М., Федоренко В.А. Характеристика мутантов Streptomyces kanamyceticus, устойчивых к аминогликозидным антибиотикам // Антибиот. и химиотер. – 1996. – Т.41,№6.-С.15-20.

   11. Голец Л.М., Есипов С.Е., Федоренко В.А. Метаболиты, образуемые мутантами Streptomyces kanamyceticus с нарушенным биосинтезом канамицина // Антибиот. и химиотер. – 1997. – Т.42,№4.-С.8-12.

   12. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов штамма Saccharopolyspora erythraea, устойчивых к тиострептону // Антибиот. и химиотер. – 1997. – Т.42,№1.-С.7-11.

   13. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Локализация детерминантов устойчивости к рифампицину на генетической карте Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. – 1997. – Т.42,№8.-С.14-20.

   14. Федоренко В.А., Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Крюгель Г. Анализ перестроек генома у мутантов Streptomyces kanamyceticus // Антибиот. и химиотер. – 1998. – Т.43,№4.-С.14-19.

   15. Demydchuk J., Oliynyk Z., Fedorenko V. Analysis of a kanamycin resistance gene (kmr) from Streptomyces kanamyceticus and a mutants with increased aminoglycoside resistance // J.Basic Microbiol. – 1998. – Vol.38, N4.- P.231-239.

   16. Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов Saccharopolyspora erythraea, устойчивых в хлорамфениколу // Антибиот. и химиотер. – 1999. – Т.44,№3.-С.5-10.

   17. Федоренко В.О. Конструювання штамів-продуцентів антибіотика канаміцину Streptomyces kanamyceticus за допомогою методів клітинної та генної інженерії // Биол. вестник – 1999.–Т.3.№1-2.–С.111-117.

   18. Дубицька Л., Заворотна С., Осташ Б., Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC29050 та Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952 // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.49-60.

   19. Федоренко В.О. Генетична нестабільність стійкості Streptomyces ambofaciens до хлорамфеніколу // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.67-73.

   20. Громико О., Басілія Л., Кириченко Н., Федоренко В. Отримання і характеристика стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е Streptomyces globisporus // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.46-53.

   21. Мар’їна О., Заворотна С., Федоренко В. Вплив кофеїну на вияв генетичної нестабільності у Streptomyces coelicolor A3(2) // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.63-67.

   22. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Панькевич К.О., Дубицька Л.П., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюл. ін-ту сільськогосп. мікробіол.-2000.-№8.-С.27-31.

   23. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межродовая конъюгация Escherichia coli – Streptomyces globisporus 1912 c использованием интегративной плазмиды pSET152 // Генетика.-2001.-Т.37,№10.-С.1340-1347.

   24. Ostash B., Basiliya L., Gromyko O., Rebets Yu., Fedorenko V. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin biosynthesis // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.-Вип.27.-C.106-112.

   25. Pankevych K., Kruegel H., Fedorenko V. Cloning and sequencing of a putative positive transcription regulator gene of landomycin biosynthetic cluster of Streptomyces globisporus 1912 // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.- Вип.27.-С.97-105.

   26. Ostash B., Luzhetskyy A., Gromyko O., Fedorenko V. Transfer of plasmid from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Наук. вісн. Ужгород. ун-ту. Сер.біол.–2001.-№10.-С.147-149.

   27. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952, cтійких до антрациклінових антибіотиків // Мікробіол.журн.- 2001.-Т.63,№4.-С.53-61.

   28. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Мар’їна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. У 4 т. / Редкол.: В.В.Моргун (головн. ред.) та ін.–К.:Логос,2001.–Т.1.-С.469-476.

   29. Федоренко В.О., Заворотна С.А., Голець Л.М., Настасяк І.М., Мар’їна О.В., Басілія Л.І., Кириченко Н.В., Демидчук Ю.О. Механізми генетичної нестабільності ознак актиноміцетів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. У 4 т. / Редкол.: В.В.Моргун (головн. ред.) та ін.– К.:Логос, 2001.–Т.1.-С.462-468.

   30. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2, cтійких до хлорамфеніколу // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2002.-Вип.28.-С.105-113.

   31. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Конструювання штамів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2 з підвищеною здатністю перетворювати даунорубіцин в доксорубіцин // Біополімери і клітина-2002.-Т.18,№2.-С.91-95.

   32. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136 // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2002.-Вип.29.-С.62-68.

   33. Дубицкая Л.П., Федоренко В.А. Влияние глюкозы на антиботическую активность и резистентность к антибиотикам у Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 и его мутантов // Антибиот. и химиотер. – 2002. – Т.47,№6.-С.7-11.

   34. Cидоров Ю.І., Федоренко В.О., Громико О.М., Новіков В.П., Влязло Р.Й., Верес.Р.М. Розрахункова модель виробництва протипухлинного антибіотика “Ландоміцин Е” // Вісн. Націонал. ун-ту “Львівська політехніка”. Хімія, технологія речовин та їх застосування. – 2002.-№461.-С.204-208.

   35. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Brana A., Salas J.A., Bechtold A., V.Fedorenko. Production of landomycins in Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Let.-2003.-Vol. 222, Is.1. –P.149 – 153.

   36. Ostash B., Rebets Y., Yuskevich V., Luzhetskyy A., Tkachenko V., V.Fedorenko. Targeted disruption of Streptomyces globisporus lndF and lndL cyclase genes involved in landomycin E biosynthesis // Folia Microbiol.-2003.-Vol.48.-P.484-488.

   37. Ostash B., Rebets Yu., Samborskyy M., Salas J.A., Fedorenko V. Sequencing and analysis of putative 3D-4H ring cyclase gene lndF of Streptomyces globisporus 1912 landomycin E biosynthetic gene cluster // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2003.-Вип.32.-C.84-91.

   38. Rebets Yu., Ostash B., Gromyko O., Mik U., Basiliya L., Fedorenko V. Resistance of recombinant Streptomyces albus CEST 114 and Streptomyces globisporus strains to landomycin E // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2003.-Вип.33.-C.47-54.

   39. Громико О.,Басілія Л.,Федоренко В. Вплив мутагенів на антибіотичну активність Streptomyces globisporus 1912 - продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е // Наук.вісн. Львів. держ. акад. вет. мед.-2003.- Т.5, (№2).-Ч.3. – С.45-52.

   40. Ostash B., Rix U., Remsing Rix L.L., Tao Liu, Lombo F., Luzhetskyy A., Gromyko O., Wang C., Brana A.F., Mendez C., Salas J.A., Fedorenko V., Rohr J. Generation of novel landomycins by combinatorial biosynthetic manipulation of the lndGT4 gene of the landopmycin E cluster in S.globisporus // Chemistry and Biology-2004.-Vol.11.-N.4.-P.547-555.

   41. Gromyko O., Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Fukuchara M., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it’s initial characterization // J.Antibiot.-2004.-Vol.57.-N.6-P.383-389.

   42. Cпосіб отримання штамів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2 з підвищеним біосинтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин. Патент UA50047A, МПК7C12N13/03 / Федоренко В.О., Дубицька Л.П. - Заявл.16.03.200; Опубл.15.10.2002.-Бюл.№10. - 10 с.

   43. Спосіб отримання штамів Streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Федоренко В.О., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужецький А.М. – Заявл. 24.01.2003; Опубл.15.12.2003.- Бюл.№12. - 10 с.

   44. Штам актиноміцетів Streptomyces globisporus Smy622 – продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Громико О.М., Федоренко В.О., Басілія Л.І. - Заявл. 3.06. 2003; Опубл. 15.04.2004.-Бюл.№4.-4 с.

   45. Zavorotna S., Fedorenko V. The pSE201 plasmid of Saccharopolyspora erythraea. // Abstr. 7^th Int. Symp. Genet. Ind. Microorg., Montreal, June 26-July 1, 1994 – P.252.

   46. Golec L., Basiliya L., Mazepa A., Kirichenko N., Esypov S., Fedorenko V. Identification of genes controlling the kanamycin biosynthesis in Streptomyces kanamyceticus // Abstr. VAAM Workshop “Biologie der Actinomyceten”, Mnster, Sept.24-26, 1995.-P.30.

   47. Golec L., Sambir M., Mazepa A., Fedorenko V. Genetic recombination during protoplast fusion Streptomyces kanamyceticus // Abstr. 10^th Int. Symp. Biol. Actinom., Bejing, May 27-30, 1997.-10P1.

   48. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechtold A., Fedorenko V. Conjugal transfer of plasmid DNA from Esherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: effects of chromosomal insertions on kanamycin production // Abstr. VAAM Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduzenten”, Freiburg, Sept.29-Oct.1, 2003.-V3.

   49. Ostash B., Luzhetskyy A.,Yuskevich V., Hrek M., Salas J.A., Bechtold A., Rohr J., Fedorenko V. Generation of novel landomycin through genetic engineering // Abstr. Int. Weigl Conf. “Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance”, Lviv, Sept.11-14, 2003.-P.126.