Анотація до роботи:

Дрель В.Р. Ідентифікація і характеристика білків-партнерів, що взаємодіють із SH3-вмісним адаптерним білком Ruk в клітинах ембріональної нирки людини лінії HEK293. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2004.

Дисертаційна робота присвячена ідентифікації білків-партнерів, що зв’язуються з адаптерним білком Ruk_l в клітинах ембріональної нирки людини лінії HEK293 та подальшому з’ясуванню їхньої функціональної активності. З використанням підходів біоінформатики, було передбачено ряд потенційних центрів посттрансляційної модифікації білка, можливість локалізації Ruk_l як в цитоплазмі, так і в ядрах клітин. Дослідження білок-білкових взаємодій, опосередкованих білком Ruk_l, здійснювали за допомогою таких методів молекулярної та клітинної біології як ПЛР, методи культури клітин, імунофлуоресцентна мікроскопія, трансфекція, афінна хроматографія, Вестерн-блотинг, затримка ДНК-білкових комплексів при електрофорезі в ПААГ.

Імунофлуоресцентною мікроскопією клітин HEK293, трансфікованих вектором pRc/CMV2/Ruk_l-Glu-tag, та Вестерн-блотингом цитоплазматичної і ядерних фракцій трансфікованих і інтактних клітин HEK293, а також клітин лінії U937 було показано, що рекомбінантний і ендогенний білки Ruk_l можуть локалізуватись як у цитоплазмі, так і в ядрі клітин. Встановлено, що афінно очищені препарати Ruk_l Glu-tagged і Ruk_l володіють здатністю зв’язуватись із ДНК і гідролізувати останню залежно від присутності іонів Mg²⁺ і Ca²⁺, в той час як іони Zn²⁺ і гепарин виявляють інгібуючий вплив на нуклеазну активність. Картовано C-кінцевий суперспіралізований “coiled-coil” район, як область взаємодії із нуклеазою/(нуклеазами). Обговорюється можлива біолоічна роль адаптерного білка Ruk в регуляції катаболізму ДНК при індукції апоптозу клітин.

В результаті проведення комплексу експериментальних робіт отримані нові дані відносно біологічних властивостей адаптерного білка Ruk. Встановлено, що адаптерний білок Ruk_l може локалізуватись як в цитоплазмі, так і в ядрах клітин HEK293 та U937. З’ясовано, що досліджуваний білок може прямо чи опосередковано взаємодіяти з ДНК. Показано, що в афінно очищеному препараті рекомбінантного білка Ruk_l Glu-tagged присутні принаймні два білки, які володіють спорідненістю до ДНК. Встановлено, що як ендогенний, так і рекомбінантний білок Ruk_l асоційовані з нуклеазою/(нуклеазами).

1. Здійснено детальний аналіз структурно-функціональної організації адаптерного білка Ruk за допомогою підходів біоінформатики, що дозволило передбачити:

можливість локалізації Ruk_l в ядрі клітин;

потенційні центри фосфорилювання Ser/Thr- специфічними протеїнкіназами;

центри, що забезпечують везикулярну локалізацію Ruk_l;

можливе залучення адаптерного білка Ruk_l до регуляції адгезивних властивостей клітин.

2. Методом імунофлуоресцентної мікроскопії вперше показано, що рекомбінантний білок Ruk_l Glu-tagged локалізується як в цитоплазмі, так і в ядрі клітин HEK293 з формуванням чітких пунктатів, локалізованих в ядрі.

3. Отримано та охарактеризовано афінно очищені препарати рекомбінантних l, m та h Glu-tagged ізоформ Ruk та ендогенного білка Ruk_l із лізатів клітин HEK293.

4. Вперше виявлено здатність афінно очищених препаратів Ruk_l Glu-tagged та ендогенного білка Ruk_l специфічно взаємодіяти із ДНК.

5. Вперше охарактеризовано здатність надмолекулярних комплексів, опосередкованих адаптерним білком Ruk, гідролізувати ДНК.

6. Картовано C-кінцевий “coiled-coil” район Ruk, як область взаємодії із нуклеазою/(нуклеазами).

Публікації автора:

1. Кіт Ю., Шуваєва Г., Дрель В., Ігуменцева Н., Дробот Л. Дослідження експресії дезоксирибонуклеаз у клітинах ссавців методом ренатурації білків у поліакриламідному гелі // Укр. Біохім. Журнал. - 2002. - том 74, №3. - С. 116-119.

2. Кіт Ю., Шуваєва Г., Дрель В., Ігуменцева Н., Дробот Л. Дослідження нуклеазної активності клітинних лізатів методом ренатурації білків у поліакриламідному гелі // Вісник Львів. Ун-ту. - 2002. - том 28. - С. 28-33.

3. Дрель В.Р., Паливода О.Ю., Шуваєва Г.Ю., Ігуменцева Н.І., Кіт Ю.Я., Гут І.Т., Бухман В.Л., Дробот Л.Б. Адаптерний білок Ruk локалізований в ядрі клітин // Биополимеры и клетка. - 2002. - том 18, №4. - С. 312-318.

4. Kit Y.Y., Drel V.R., Petriv O.I., Kovalyova V.A., Shuvaeva G.Y., Palivoda O.Y., Vovk E.I., Bobak Y.P., Rzeszowska-Wolny J., Gout I.T., Buchman V.L., Drobot .LB. Adaptor protein Ruk1 forms protein-protein complexes with endonuclease activity in HEK293 cells //Biochemistry (Mosc).-2003.-Vol.68, №7.-P.810-815.

5. Petriv O., Kit Yu., Drel’ V., Makhnevych T., Gout I., Buchman V., Drobot L. Functional characterization of a novel phosphoinositide 3-kinase binding protein Ruk. // Abstracts of 3^rd Parnas Conference. - Lviv (Ukraine). - 2000. - P. 103.

6. Drel’ V., Shuvayeva G., Filyak Ye. Study of the expression of Ruk/CIN85-related proteins in Drosophila melanogaster ontogenesis // Abstracts of Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P. 32.

7. Kit Yu. Ya., Drel’ V.R., Shuvayeva H.Yu., Palyvoda O.Yu. Kovalyova V.A., Vovk O.I., Bobak Ya.P., Gout I.T., V. Buchman V.L., Drobot L.B. Ruk adaptor proteins - integrators of signaling pathways // Abstracts of 4^rd Parnas Conference. - Wroclav (Poland). - 2002. - P. 16.

8. Дрель В.Р., Кіт Ю.Я., Данилюк О.Ю., Шуваєва Г.Ю., Ігуменцева Н.І. Адаптерний білок Ruk_l, який локалізований в ядрі клітин // Укр. Біохім. Журнал. - 2002. - том 74, №4а (додаток 1). - Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду. - Чернівці (Україна). - С. 38-39.

9. Кіт Ю.Я., Дрель В.Р., Шуваєва Г. Ю, Петрів О.І., Паливода О.Ю., Ковальова В. А., Вовк О.І., Ігуменцева Н.І., Дробот Л. Б., Гут І.Т. Адаптерний білок Ruk/СIN85 в клітинах НЕК293 утворює білок-білкові комплекси, які володіють ендонуклеазною активністю // Укр. Біохім. Журнал. - 2002. - том 74, №4б (додаток 2). - Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду. – Чернівці (Україна). - С. 7-8.

10. Kit Yu.Ya., Drel’ V.R., Shuvayeva H.Yu., Palyvoda O.Yu., Kovalyova V.A., Vovk O.I., Igumenceva N.I., Bobak Ya.P., Rzeszowska J., Gout I.T., Buchman V.L., Drobot L.B. Ruk adaptor proteins - structural and functional features // Abstracts of Gliwice scientific meeting, “Gliwickie spotkania naukowe”. - Gliwice (Poland). - 2002. - P. 141.

11. Дрель В.Р. Адаптерний білок Ruk_l виявляє здатність зв’язувати та гідролізувати ДНК // Укр. Біохім. Журнал. - 2002. - том. 74, №4. Тези доповідей міжгалузевої конференції молодих науковців. - Київ (Україна). - С. 153-154.

12. Шуваєва Г. Ю, Бобак Я.П., Дрель В.Р., Ковальова В. А., Дульцева Н.М., Ігуменцева Н.І., Маєвська О.М., Федишин Я.Я., Воробець Д.З., Шуляк О.В., Борис Ю.Б., Дробот Л. Б. Дослідження експресії ізоформ адаптерного білка Ruk в пухлинах нирки та передміхурової залози людини // Матеріали всекраїнської науково-практичної конференції “Біохімія”. - Дніпропетровськ (Україна). - 2003. - С. 49-50.

13. Kit Yu., Drel’ V., Shuvayeva H., Palyvoda O., Kovalyova V., Havrylov S., Fedyshyn Ya., Czajkowski R., Bobak Ya., Rzeszowska J., Gout I., Buchman V., Drobot L. Ruk adaptor protein: a regulator of multiple intracellular signal transduction events // Interactions in Macromolecular Assemblies. - Druskininkai (Lithuania). - 2003. - P. 21.

14. Drel V.R., Kit Yu.Ya., Kovalyova V.A., Bobak Ya.P., Drobot L.B. Protein complexes mediated by adaptor potein Ruk/CIN85/SETA possess endonuclease activity // Abstracts of Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. - Kyiv (Ukraine). - 2003. - P. 55.