Анотація до роботи:

ГРЕБІНИК Д.М. Кальцієвий гомеостаз на ранніх етапах апоптозу тимоцитів щура. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – Біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ. - 2005.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженню концентрації Са²⁺ в цитозолі та активності Са²⁺-транспортних систем мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму тимоцитів на ранніх етапах апоптозу, викликаного іонізуючою радіацією у дозі 4,5 Гр або пероксидом водню у концентрації 0,1 мМ.

Виявлено, що після рентгенівського опромінення ізольованих тимоцитів концентрація Са²⁺ у цитозолі не змінюється, тоді як за дії Н₂О₂ - значно підвищується у період, що передує міжнуклеосомній фрагментації ДНК. Спричинена дією Н₂О₂ фрагментація ДНК запобігається у випадку зниження концентрації Са²⁺ у цитозолі. Визначено активність та розраховано кінетичні параметри Са²⁺-акумулюючих систем мітохондрій та ЕПР пермеабілізованих дигітоніном тимоцитів у контролі та за дії досліджуваних апоптогенних чинників. Встановлено, що провідна роль Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій у накопиченні Са²⁺ з цитозолю на ранньому етапі після дії Н₂О₂ втрачається, знижується накопичення катіону в ЕПР. Менш значне пригнічення Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій виявлено у опромінених клітинах.

1. На ізольованих тимоцитах щура проведено порівняльне дослідження концентрації Са²⁺ та параметрів Са²⁺-транспортних систем мітохондрій та ЕПР у контролі та за дії апоптогенних чинників - іонізуючої радіації (4,5 Гр) та Н₂О₂ (0,1 мМ). Виявлено відмінності у функціонуванні систем підтримання кальцієвого гомеостазу та встановлено можливі причини його порушення на ранньому етапі апоптозу тимоцитів.

2. Концентрація вільного Са²⁺ у цитозолі тимоцитів не змінюється упродовж 5-годинної інкубації клітин у контролі та після рентгенівського опромінення. За інкубації тимоцитів у присутності 0,1 мМ Н₂О₂ відбувається значне підвищення [Ca²⁺]_i, яке виявляється через 15 хв після дії чинника, перевищує контрольний рівень у 6 разів через 3 год інкубації і залишається у 3,5 рази вищим порівняно з контролем через 5 год.

3. Через 3 год після дії досліджуваних чинників виявлено зростання вмісту продуктів міжнуклеосомного розщеплення ДНК у тимоцитах. У випадку зниження концентрації Са²⁺ у цитозолі клітин (інкубація у номінально безкальцієвому середовищі) фрагментація ДНК, спричинена дією Н₂О₂, запобігається, а у опромінених тимоцитах - послаблюється

4. Вхід Са²⁺ через плазматичну мембрану тимоцитів не є причиною підвищення [Ca²⁺]_i на ранньому етапі дії Н₂О₂ (до 1 год), оскільки пасивний вхід катіона у клітини не посилюється, а внесення у середовище інкубації блокаторів Са²⁺-каналів плазматичної мембрани верапамілу та ніфедіпіну, так само як і заміна Na⁺ на холін для пригнічення Na⁺/ Са²⁺-обмінника не впливають на спричинене дією Н₂О₂ підвищення [Ca²⁺]_i.

5. Виявлено, що внесення Н₂О₂ у суспензію тимоцитів, попередньо інкубованих у номінально-безкальцієвому середовищі та оброблених тапсигаргіном з метою спустошення Са²⁺-депо ЕПР, викликає додаткове підвищення [Ca²⁺]_i.

6. За інкубації тимоцитів у присутності 5 мкМ циклоспорину А спричинене дією H₂O₂ підвищення [Ca²⁺]_і у період до 15 хв інкубації повністю попереджається, а у подальшому рівень [Ca²⁺]_i виявляється зниженим у 2 рази, що вказує на внесок Са²⁺-пулу мітохондрій у дисбаланс кальцієвого гомеостазу.

7. Пермеабілізовані дигітоніном тимоцити здатні накопичувати Са²⁺ з середовища інкубації. Визначено активність Са²⁺-транспортних систем мітохондрій і ЕПР та встановлено, що початкова швидкість акумуляції Са²⁺ (V₀ ) є значно вищою у мітохондріях, ніж у ЕПР ( 106 ± 9 та 14 ± 2 пмоль Ca²⁺/хв на 10⁶ клітин відповідно).

8. Активність Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій тимоцитів значно пригнічується через 15 хв після дії Н₂О₂, акумуляція катіону в ЕПР знижується меншою мірою, таким чином, домінуюча роль мітохондрій у накопиченні Са²⁺ з цитозолю втрачається.

9. Після опромінення тимоцитів функціональна активність Са²⁺-транспортної системи ЕПР зберігається, однак акумуляція катіону мітохондріями пригнічується. Таке пригнічення є менш значним і виявляється пізніше, ніж після дії Н₂О₂.

Публікації автора:

1. Борисов С. І., Гребіник Д. М., Матишевська О. П. Са²⁺-АТФазна активність та АТФ-залежне накопичення Са²⁺ у ядрах лімфоцитів селезінки Х-опромінених тварин // Вісник Київського університету. Серія Біологія. – 2001. – № 33. – С. 21-23. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури за темою досліджень, виділення лімфоїдних клітин з селезінки щурів)

2. Матишевська О. П., Борисов С. І., Гребіник Д. М. Особливості регуляції концентрації Са²⁺ у ядрі // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т. 74, №5. – С. 5-11. (Особистий внесок здобувача – участь у опрацюванні, аналізі та інтерпретації літературних даних, написання окремих частин огляду).

3. Гребіник Д.М., Артеменко O.Ю., Семенов Ю.В., Зима В.Л., Матишевська О.П. Вплив рентгенівського опромінення і пероксиду водню на концентрацію вільного цитозольного Са²⁺ у тимоцитах // Вісник Київського університету. Серія Біологія. – 2003. – № 38. – С. 16-18. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури, виділення тимоцитів, навантаження клітин зондом, підготовка клітин до вимірювання концентрації Са²⁺).

4. Гребинык Д. М., Коваль Т. В., Матышевская О. П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. I. Повышение концентрации цитозольного Са²⁺ на ранней стадии апоптоза, индуцированного пероксидом водорода // Український біохімічний журнал. – 2004. – Т. 76,№ 6. – С. 63 – 69. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури, виділення тимоцитів, опромінення суспензії клітин, інкубація та навантаження клітин зондом, вимір концентрації Са²⁺ у цитозолі тимоцитів).

5. Гребинык Д. М., Гринюк И. И., Матышевская О. П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. II. Аккумуляция Са²⁺ митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77,№ 2. – С. 78 – 81. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури за темою досліджень, виділення тимоцитів, інкубація клітин та їх пермеабілізація дигітоніном, визначення швидкості Са²⁺-транспортних процесів радіоізотопним методом).

6. Borysov S., Matyshevska O., Semenov J., Grebinyk D., Kucherenko M.. ATP-dependent Ca2+ accumulation in rat spleen lymphocyte nuclei and its increasing during radiation-induced apoptosis // Abstracts of EMBO Workshop on Signal Transduction-Mediated Regulation of Nuclear Transport (August, 11-14, 2001). – Strasbourg,2001. - P. 57.

7. Koval T. V., Dvorshchenko K. O., Grebinik D. M.. Complex study of DNA lesions during radiation- and H₂O₂-induced apoptosis in cells population // Conference for students, PhD-students and young scientists on molecular biology and genetics (September, 20-22, 2001). –– Kyiv,2001. - P. 46.

8. Гребіник Д. М., Борисов С. І., Семьонов Ю. В. Транспорт Ca²⁺ в ядрах лімфоцитів селезінки х-опромінених щурів // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. – Т. 74,№ 4б(додаток 2). Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду (1-3 жовтня, 2002). – Чернівці, 2002. - С. 217.

9. Koval T. V. Grebinyk D. M., Gerasimenko O. O. Changes in GSH level and free cytosolic Ca²⁺-concentration preceed DNA fragmentation during H₂O₂-induced thymocyte apoptosis // Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetics (September, 25-27, 2003). – Kyiv, 2003. – P. 87.

10. Grebinyk D., Semenov Y., Matyshevska O.. Increased level of free cytosolic Ca²⁺ in H₂O₂-treated rat thymocytes is the result of Ca²⁺ depots depletion // Blackwell publishing. Abstracts of the 29^th meeting of the federation of the European biochemical societies (26 June – 1 July, 2004). – Warsaw, 2004. - P. 190-191.

11. Grebinyk D., Semenov Y., and Matyshevska O. Increased level of free cytosolic Ca²⁺ in H₂O₂-treated rat thymocytes is the result of Ca²⁺ depots depletion // Abstracts of the Forum of young scientists of 29^th meeting of the federation of the European biochemical societies (June 24-26, 2004). – Warsaw, 2004. - P. 23.

12. Grebinyk D. M., Koval T. V., Grynyuk I. I., Matyshevska O. P. Oxidative stress and increase in cytosolic Ca²⁺ precedes DNA fragmentation during H₂O₂-induced thymocyte apoptosis // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. –– Т. 77,№2. Abstracts of 5^th Parnas conference “Molecular mechanisms of cellular signalling” (April, 27-29, 2005). - Kyiv, 2005.- P. 109.