Анотація до роботи:

Данилович Г.В. Кінетичні властивості Mg²⁺-залежної АТРази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню кінетичних, каталітичних властивостей та механізму реакції Mg²⁺-залежного гідролізу АТР, що каталізується “базальною” Mg²⁺-АТРазою плазматичної мембрани клітин міометрія.

Із використанням флуоресцентного зонду 9-аміноакридину, дигітоніну та протонофору СССР показано, що “базальна” Mg²⁺-АТРаза сарколеми, яка є резистентною до дії оуабаїну, азиду натрію та тапсигаргіну, здатна забезпечувати утворення D рН на плазматичній мембрані.

Виявлено лінійну залежність між активністю “базальної” Mg²⁺-АТРази та збільшенням рН в діапазоні 6,0-8,0.

“Базальна” Mg²⁺-АТРазна активність сарколеми міоцитів ефективно інгібується еозином Y (К_і=45,30±14,50 мкМ) та о-ванадатом (К_і=1,35±0,28 мМ). В основі кінетичного механізму впливу еозину Y лежить зниження максимальної початкової швидкості реакції ферментативного гідролізу АТР, визначену як за Mg²⁺, так і за АТР, а також зменшення спорідненості Mg²⁺-АТРази до Mg²⁺ і АТР.

Виявлено тенденцію до стимуляції Mg²⁺-АТРазної активності сперміном, спермідином та путресцином в концентраціях 0,05-10 мМ у середньому на 20-30 %.

На підставі результатів кінетичного аналізу, проведеного в рівноважному режимі, запропоновано модель можливого кінетичного механізму Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР, який передбачає існування на ферменті двох окремих центрів зв’язування іонів Mg та вільного АТР^4-.

1. Mg²⁺-залежним АТРазам належить фундаментальна роль у забезпеченні іонного обміну через плазматичну мембрану. Цей обмін є одною з центральних ланок механізму електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких мязах. Дослідження реакції “базального” Mg²⁺-залежного гідролізу АТР в плазматичній мембрані є важливим для розуміння процесів регуляції іонного транспорту в цій структурі. У дослідах, виконаних на обробленій розчином дигітоніну фракції плазматичних мембран гладеньком’язових клітин матки свиней, проведено комплексне дослідження кінетичних та каталітичних властивостей реакції “базального” Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР, її причетності до створення транссарколемального протонного градієнта, чутливості до дії деяких ефекторів (інгібітори, поліаміни). Запропоновано кінетичну модель можливого механізму цієї реакції.

2. Із використанням специфічних інгібіторів Mg²⁺-залежних АТР-гідролаз, флуоресцентного зонду 9-аміноакридину, дигітоніну та протонофору СССР продемонстровано, що “базальна” Mg²⁺-АТРаза сарколеми (питома ферментативна активність – 11,8 ± 1,2 мкмоль Р_і/мг білка за год) здатна забезпечувати створення трансмембранного протонного градієнта.

3. Доведено, що кінетика Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР в діапазоні часу до 10 хв підпорядковується закономірностям хімічної реакції нульового порядку (значення початкової швидкості V₀ становить 250±30 нмоль Р_і/мг білка за хв). Величини оптимальних концентрацій іонів Mg та АТР становлять 0,5-3 та 0,3-1 мМ відповідно. Значення константи активації іонами Mg K_Mg та константи Міхаеліса K_m за АТР дорівнюють 286,7±27,6 та 48,5±8,0 мкМ відповідно, а величини початковоої максимальної швидкості гідролізу за Mg²⁺ V_Mg та за АТР V_ATP складають 34,6±4,3 та 33,1±4,8 мкмоль Р_і/мг білка за год відповідно.

4. “Базальна” Mg²⁺-АТРазна активність не є специфічною до АТР (також гідролізуються CTP, GTP, UTP) та до катіона-активатора (гідроліз АТР має місце не лише у присутності Mg²⁺, але й у присутності Ca²⁺, Co²⁺, Mn²⁺). Ізотонічна заміна катіонів Na на катіони K, Li, Rb, холін (у разі використання хлоридів) або на ізотонічну сахарозу, аніонів Cl на аніони Br чи I (у разі використання калієвих солей) практично не впливає на Mg²⁺-АТРазну активність. Активація “базальної“ АТРази іонами Mg не залежить від хімічної природи аніону у складі магнієвої солі (Cl^- чи SO₄^2-).

5. Швидкість реакції “базального” ферментативного Mg²⁺-залежного гідролізу АТР зростає лінійно зі збільшенням рН в діапазоні 6,0-8,0. Припускається, що така рН-залежність АТР-гідролазної реакції може мати функціональне значення у контролі внутрішньоклітинного протонного гомеостазу.

6. “Базальна” Mg²⁺-АТРазна активність інгібується еозином Y, а також о-ванадатом (значення уявної константи інгібування К_і становлять 45,30 мкМ та 1,35 мМ відповідно). Показано, що кінетичний параметр V_АТР/K_m (каталітична ефективність ферменту за умов його насичення іонами Mg) дуже чутливий до гальмівної дії еозину Y, на відміну від параметру V_Mg/К_Mg (каталітична ефективність ферменту за умов його насичення нуклеозидтрифосфатом),. Припускається, що “атака” еозину Y на Mg²⁺-АТРазу відбувається переважно на рівні АТР-зв’язувального, а не Mg²⁺-зв’язувального центра.

7. При вивченні впливу сперміну, спермідину та путресцину спостерігається тенденція до стимуляції “базальної” Mg²⁺-АТРазної активності у присутності цих природних поліамінів в фізіологічних (до 1 мМ) і вище (до 10 мМ) концентраціях у середньому на 20-30 %.

8. На підставі тлумачення результатів кінетичного аналізу, проведеного в рівноважному режимі, запропоновано кінетичну модель можливого механізму реакції Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР, який передбачає наявність на ферменті двох окремих центрів зв’язування для іонів Mg та вільного АТР^4- (реальний субстрат).

Публікації автора:

1. Данилович Г.В., Костерін С.О. Ідентифікація та характеристика “базальної” Са²⁺-незалежної Mg²⁺-залежної АТР-гідролазної ферментативної активності у фракції плазматичних мембран гладеньком’язових клітин // Укр. біохім. журн. –2001. - Т. 73, № 6. - С. 30-40.

2. Данилович Г.В. Вплив еозину Y на Са²⁺-незалежну Mg²⁺-залежну АТР-азну активність плазматичних мембран гладеньком’язових клітин // Укр. біохім. журн. –2004. - Т. 76, № 2. - С. 48-52.

3. Данилович Г.В., Костерін С.О. Кінетичні закономірності перебігу та можливий механізм реакції Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР у фракції плазматичних мембран гладеньком’язових клітин // Укр. біохім. журн. –2004. - Т. 76, № 6. - С. 142-150.

4. Данилович Г.В., Грузина Т.Г., Ульберг З.Р., Костерін С.О. Ідентифікація та каталітичні властивості Mg²⁺-залежної АТР-гідролази цитоплазматичної мембрани Bacillus sp. В4253, здатних до накопичення золота // Укр. біохім. журн. –2004. - Т. 76, № 5. - С. 45-51.

5. Данилович Г.В. “Базальна” Mg²⁺-АТР-азна активність у сарколемі гладеньком’язових клітин та деякі її характеристики // Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства з міжнародною участю. – Львів. – 2002. – С. 110.

6. Данилович Г.В. Вплив неспецифічних інгібіторів транспортних АТР-аз на “базальну” Mg²⁺-АТР-азну активність сарколеми міометрія // Матеріали VIIІ Українського біохімічного з’їзду. Чернівці. - Укр. біохім. журн. –2002. - Т. 74, № 4а. - С. 37.

7. Danylovych H.V. Effect of eosin Y on the kinetic parameters of Mg²⁺-dependent hydrolysis of ATP in the plasma membrane of myometrial cell // II международный симпозиум “Физиология и биофизика гладких мышц”. – Киев, Украина. – Нейрофизиология.- Т.35.- № 3/4.- 2003. – С. 339.

8. Данилович А.В. Механизм действия эозина Y на Mg²⁺-зависимый ферментативный гидролиз АТР в плазматической мембране клеток миометрия // ІII съезд биофизиков России. Тезисы докладов. – Воронеж. – 2004. – С. 206-207.

9. Данилович Ганна. Кінетична інтерпретація можливого механізму реакції гідролізу АТР, яка каталізується “базальною” Mg²⁺-АТРазою плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології. Тези доповідей. – Львів. – 2004. – С. 241.