Анотація до роботи:

Вадзюк О.Б. Кінетика транспорту іонів Са у мітохондріях матки щурів та вплив кофеїну на цей процес.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена вивченню кінетичних властивостей транспорту іонів Са у мітохондріях міометрія. З використанням методу флуоресцентної спектроскопії вперше в термінах константи швидкості транспортного процесу k досліджено кінетику акумуляції іонів Са у мітохондріях гладенького м’яза матки, продемонстровано, що цей процес задовольняє закономірностям хімічної реакції першого порядку, k = (4,8 ± 0,7)x10^-2 с^-1. Протонофор СССР та азид здатні викликати пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього накопичення цього катіону в них. Для константи швидкості транспортного процесу k є властивою куполоподібна залежність від концентрації Mg²⁺ (оптимальна величина – 3 - 5 мМ). Транспортний процес характеризується абсолютною специфічністю щодо АТР та залежністю константи швидкості від концентрації цього нуклеозидтрифосфату, але практично не є чутливим до присутності сукцинату. Кофеїн дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (константа інгібування І_0.5 становить 10,4 ± 1,8 мМ) та стимулює пасивний вихід Са²⁺ з мітохондріального матриксу у середовище за умов попереднього навантаження ними мітохондрій. Також показано інгібування Н⁺-АТРазної активності в мітохондріях під дією кофеїну.

Циклоспорин А (5 мкМ) стимулює акумуляцію іонів Са в МХ міометрія приблизно на 30 %, але не впливає на індуковане азидом пасивне вивільнення Са²⁺ з них. На фоні інгібуючої дії кофеїну на накопичення іонів Са циклоспорин А не стимулює цей процес.

В ході виконання роботи був розроблений флуоресцентний метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.

Отримані в роботі дані можуть бути корисними для подальшого дослідження мембранних механізмів, що задіяні у регуляції концентрації Са²⁺ у гладеньких м’язах, ролі мітохондрій у забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в гладеньких м’язах.

1. На теперішній час доведена важлива роль мітохондрій у контролі внутрішньоклітинної концентрації іонів Са, у тому числі в гладеньких м’язах. У даній роботі, виконаній із використанням Са²⁺-чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну, були досліджені кінетичні закономірності транспорту іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія невагітних щурів, вивчено вплив кофеїну на цей процес.

2. Наші дані свідчать, що протонофор- та азид-чутливі складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну, які є резистентними до тапсигаргіну, характеризують Mg²⁺,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са в мітохондріях. Кінетика акумуляції Са²⁺ задовольняє закономірностям реакції першого порядку (константа швидкості k становить (4,8 ± 0,7) x10^-2 с^-1).

3. Протонофор СССР, азид та Са²⁺-іонофор А-23187 стимулювали пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього енергозалежного накопичення цього катіону в них. Протонофор здатний більш ефективно, ніж азид, індукувати вивільнення Са²⁺ із цих субклітинних структур: значення k становлять (8,6 ± 0,8) x10^-2 та (3,8 ± 0,2) x10^-2 с^-1 відповідно.

4. Величина константи швидкості k акумуляції іонів Са у мітохондріях куполоподібно залежить від концентрації іонів Mg (оптимальне значення – 3 – 5 мМ) та збільшується із зростанням концентрації АТР (до 3 мМ), але практично не залежить від концентрації сукцинату (до 3 мМ) у середовищі інкубації.

5. Кофеїн, внесений у середовище інкубації, дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (значення константи інгібування І_0.5 становить 10,4 ± 1,8 мМ) та Н⁺-АТРазну активність в мітохондріях, зменшуючи як платовий (у часі) рівень акумуляції катіону, так і величину константи швидкості цього процесу. У випадку попередньої інкубації мітохондрій з кофеїном при відсутності реагентів, що забезпечують транспортний процес (Са²⁺, Mg²⁺, АТР) також спостерігається пригнічення акумуляції іонів Са. Кофеїн стимулює пасивне вивільнення іонів Са з мітохондрій, які попередньо були навантажені цим катіоном у енергозалежному процесі.

6. Циклоспорин А (5 мкМ) стимулює на (30 %) акумуляцію іонів Са в мітохондріях, але не впливає на їх пасивний вихід із цих субклітинних структур. На фоні пригнічуючої дії кофеїну (20 мМ) на акумуляцію іонів Са стимулюючий ефект циклоспорину А (5 мкМ) не спостерігається.

7. Із використанням флуоресцентного зонду 3-гідрокси 4-диметиламінофлавону розроблено метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.

Публікації автора:

1. Вадзюк О.Б., Борисова Л.А., Тітус О.В., Костерін С.О. Чутлива до СССР зміна флуоресценції тетрацикліну за умов моделювання Mg²⁺, АТР-залежного транспорту іонів Са в мітохондріях гладенького м’яза.// УБЖ.- 2003.- т.75, N4.- С. 64-74.

2. Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Вплив кофеїну на азидчутливе Mg²⁺, АТР-залежне збільшення флуоресцентної відповіді тетрацикліну при моделюванні акумуляції іонів Са в мітохондріях.// УБЖ.- 2003.- т. 75, N6.- С. 47 – 55.

3. Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну та ЦсА на трансмембранний обмін іонів Са в мітохондріях гладенького м’яза.// УБЖ.- 2005.- т.77, N2.- С. 77-82.

4. Pivovarenko V.P., Vadzyuk O.B., Kosterin S.O. Fluorometric detection of adenosine triphosphate with 3-hydroxy-4’(dimethylamino)flavone in aqueos solutions.// Journal of Fluorescence.- V.16, N 1.- Р.9 – 15.

5. Патент на винахід N 75448 UA, 7МПК, GO 21/64, GO1N 33/52, C07D 311/30, C07D221/06. Спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5’-трифосфату (АТР) у розчині/ Пивоваренко В.Г., Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Заявл. 15.03.2004, Опубл. 17.04.2006, Бюл. N 4.

6. Vadzyuk O.B. CCCP- and azide-sensitive Ca²⁺ accumulation in myocytes and the effect of caffeine on this process// .- International Congress “Physiology and Biophysics of the Smiito Muscle”.- 2003.-Р.377.

7. Вадзюк О.Б. Влияние кофеина на Mg²⁺,АТР-зависимое накопление ионов Са митохондриями миоцитов матки// 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых.- Сборник тезисов.-2003.-Р.313.

8. Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну на СССР- та NaN₃-чутливу Mg²⁺,АТР-залежну систему акумуляції іонів Са в клітинах міометрію.// Конференція-конкурс робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”.- Київ.- 2003.-Р.8

9. Vadzyuk O.B., Kosterin S.O. Mg²⁺, ATP-dependent Ca²⁺-transport in the mitochondria of the smooth muscle cells// 29-th Meeting of the European Biochemical Societies.-Poland.- 2004.- P.184.

10. Vadzyuk O.B. Influence of caffeine and cyclosporin A on the transmembrane exchange of Ca²⁺ in smooth muscle mitochondria// 5-th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling”. 2005.