Анотація до роботи:

Льошина Л.Г. Клонування промоторів світлозалежної та коренеспецифічної експресії чужорідних генів в клітинах рослин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2006.

Одержано та досліджено дві регуляторні послідовності, що забезпечують коренеспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів в бактеріальних та рослинних клітинах. Промотор, що має коренеспецифічні властивості отримано в результаті клонування фрагментів ядерної ДНК тютюну перед кодуючою послідовністю безпромоторного гена неоміцинфосфотрансферази–ІІ (npt-II). Відібрано фрагменти, що ініціюють транскрипцію в бактеріальних клітинах. Промоторну послідовність гена малої субодиниці рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилази (rbcS-3A) отримано шляхом її ампліфікації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Одержані послідовності проклоновано у плазмідних векторах. Рекомбинантні плазміди, що містять ці фрагменти перед репортерними генами, введені в клітини тютюну. Регуляторну активність та органоспецифічність доведено за допомогою генів npt-II та хлорамфеніколацетилтрансферази (cat). В сконструйовані вектори введено ген металотіонеїна. Показана підвищена здатність трансгенних рослин до акумуляції іонів важких металів в клітинах органів з експресією гена металотіонеїну, що вибірково індукується досліджуваними промоторами.

1. За допомогою рестриктаз BglII і EcoRI одержано фрагменти ядерної ДНК клітин тютюну для відбору з них регуляторних (промоторних) ділянок генів. Відбір промоторних послідовностей проведено за допомогою бактеріальних клітин, трансформованих векторними плазмідами, що містили маркерний ген неоміцинфосфотрансферази під різними фрагментами ядерної ДНК, вбудованими замість власного промотору маркерного гена.

2. У результаті скринінгу на середовищі з канаміцином відібрано послідовність з промоторною активністю розміром 470 п.о. Фрагмент сиквеновано, встановлено його гомологію з 3-промоторною послідовністю хлоропластного гена рибосомного білка S12 тютюну і визначені його регуляторні елементи.

3. На основі плазміди pUC19 сконструйовано вектор pUC23t, який містить досліджувану промоторну послідовність rpS12, сайт рестрикції BamHI для вбудовування структурних генів та термінатор транскрипції гена нопалінсинтази Ti-плазміди.

4. За допомогою вектора pUC23t з введеними генами npt-II та cat під контролем промоторної послідовності rpS12, отримані трансгенні рослини N. tabacum, у яких виявлена коренеспецифічна експресія маркерних генів.

5. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ампліфіковано промотор гена томату rbcS-3A, проклоновано в векторі рBluescript SK(+/-), сиквеновано та охарактеризовано його регуляторні ділянки.

6. На основі плазміди pUCt одержано експресуючий вектор з касетою rbcS3A-cat-term, який в результаті Agrobacterium-опосередкованої трансформації перенесено в рослини тютюну. Показана світлоіндукуєма та органоспецифічна експресія cat-гена в трансформованих рослинах. За допомогою делеційного аналізу промотору rbcS-3A показана наявність в ньому елементів позитивної та негативної регуляції.

7. За допомогою векторних конструкцій рUC23t та pDL1 з введеним в них геном металотіонеїну, одержані трансгенні рослини тютюну з органоспецифічною експресією гена металотіонеїна визначеною по показнику накопичення в них йонів Cu²⁺ та Cd²⁺ з живильного середовища.

Публікації автора:

1. N.V.Grzhelyak, A.P.Galkin, L.V.Gening, T.V.Medvedeva, L.G.Lioshina, O.V.Bulko, K.G.Gazaryan Chloroplast "cryptic" promoter can be activated upon their transfer to plant nuclear genome // Биополимеры и клетка.- 1996.-т.12.-№6.-С.87-93.

2. A.P.Galkin, O.V.Bulko, L.G.Lеoshina, A.N.Vasiliev, T.V.Medvedeva Clean-up of contaminated lands from heavy metals using transgenic plants // Proc. 4th Itern. Sity and on Site Phytoremeditation Symp.. New-Orlean, USA.- 1997.-V.3.-Р.325-329.

3. Л.Г.Льошина, Т.В.Медведєва, О.В.Булко, А.П.Галкін Клонування та дослідження промоторних послідовностей, що скеровують органоспецифічну та світлозалежну регуляцію химерних генів в трансформованих рослинах // Збірник праць “Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”.- 2001.-т.1- С.635-641.

4. Л.Г.Льошина, Т.В.Медвєдєва, О.В.Булко, А.П.Галкин, В.П.Кухар. Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів в трансгенних рослинах: одержання та клонування корене- бульбо- та листспецифічних промоторів // Біополімери та клітина.- 2003.- т.19.-.№2.- С.169-178.

5. А.П.Галкин, Т.В.Медведева, Л.Г.Лёшина, О.В.Булко, В.П.Кухар. Трансгенные растения: за и против // Биополимеры и клетка.- 2003.-т.19.-№4.-С.317-327.

6. А.П.Галкин, Л.Г.Лёшина, Т.В.Медведева, О.В.Булко, В.П.Кухар Регуляторные области промоторов генов растений и белки-регуляторы промоторной активности// Биополимеры и клетка.- 2004.- т.20.-.№5.- С.363-379.

7. A.P.Galkin, L.G.Lioshina, O.V.Bulko Cloning of the 3 organ-specific promoters: root-, tuber- and leafspecific // Abstr. of the IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture (14-19 June 1998).-Jerusalem (Israel).-1998.-Р.142.

8. A.P.Galkin, P.G.Kovalenko, L.G.Lioshina, O.V.Bulko, D.M.Fedoryak Obtaining of transgenic plants of tobacco and potato with organ-specific expression of hymeric metallothionein // Interactions and Intersection in Plant Signaling Pathways (February 8-14, 1999).-Idaho(USA).-1999.-Р.57.

9. L.G.Lioshina, T.V.Medvedeva, O.V.Bulko, A.P.Galkin About participation of eucariotic cys and trans factors in the regulation of procariotic (cloroplastic) promoter’s activity // International Symposium “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)”, (September 9-14, 2001).- Kiev (Ukraine).- 2001.-С.75.

10. L.Lioshina, O.Bulko The induction of extensine and metallothioneine synthesis in the cells of genetically transformed plants // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (April 25-28, 2004).-Lviv (Ukraine).- 2004.- p.106.