Анотація до роботи:

Дубицька Л. П. Конструювання та селекція штаму Streptomyces peucetius subsp. caesius - продуцента даунорубіцину та доксорубіцину. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика.- Інститут клітинної біології і генної інженерії НАН України, Київ, 2002.

Штами S. peucetius – продуцента антрациклінів, охарактеризовані за ознаками стійкості до антибіотиків та антибіотичною активністю. Створено та охарактеризовано колекцію мутантів стійких до хлорамфеніколу (CML), даунорубіцину (DNR) та доксорубіцину (DXR). Показано доцільність пошуку штамів з підвищеною продукцією DXR серед НГ - індукованих CML^r – та DXR^r - мутантів, а DNR та DXR - серед DNR^r – мутантів. Отримано мутанти цього штаму, здатні рости на повноцінних середовищах з 2-5 % глюкози (glr - мутанти), на яких не ріс вихідний штам. Антибіотична активність glr- мутантів в меншій мірі, ніж у 27952-2 підлягає глюкозній репресії, а у 17 % glr - мутантів зростає рівень синтезу антрациклінів. Показано, що одним з механізмів стійкості штаму 27952-2 до DNR є його ферментативна інактивація, з утворенням менш токсичної сполуки- DXR. DNR^r – мутанти штаму 27952-2 (з підвищеним синтезом DXR) та отримані трансформанти 27952-2 pIJ486⁺, S. lividans TK24 pIJ486⁺ (які несуть гени cpx – С-14-гідроксилаза, що каталізує утворення DXR з DNR, та dnrI- активатор транскрипції) утворюють DXR з доданого до 48 годинних культур цих штамів DNR. У 27952-2 pIJ486⁺ зростає також синтез антрациклінів, DNR та DXR.

В результаті виконаної роботи розроблено методи генетичного та генно – інженерного конструювання штамів S. peucetius - продуцентів DNR та DXR. Порівняно ознаки стійкості у цих штамів та у S. globisporus 1912– продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Досліджено зв’язок між антибіотико- резистентністю та антибіотичною активністю у штамів S. peucetius.

1. Охарактеризовано ознаки стійкості до антибіотиків трьох штамів – продуцентів ароматичних полікетидів, що мають протипухлинну активність - S. peucetius ATCC 29052, S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 (продуценти антрациклінів) та S. globisporus 1912 (продуцент ангуциклінового антибіотика - ландоміцину Е). Штами відрізняються чутливістю до тетрацикліну, хлорамфеніколу, аміноглікозидів, макролідів, лінкоміцину, рифампіцину, актиноміцину D, даунорубіцину та доксорубіцину. Всі штами мають вищий рівень стійкості до доксорубіцину (DXR), ніж до спорідненого антибіотика даунорубіцину (DNR).

2. Вивчено мінливість морфологічних варіантів S. peucetius ATCC 29050 (29050-1 та 29050-2) і S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 (27952-1, 27952-2 та 27952-3) за рівнем антибіотичної активності. Штам 27952-3 характеризується найвищою середньою антибіотичною активністю, а штам 27952-2 – найвищими ступенем варіабельності рівня антибіотичної активності та часткою “плюс” – варіантів. Лише морфологічні варіанти штаму 27952 синтезують хроматографічно тестовані DNR та DXR, але видрізняються якісним складом антрациклінових сполук та стійкістю до DNR. Штами 27952-1 та 27952-2 утворюють DXR, а 27952-3- DNR i DXR.

3. Глюкоза інгібує ріст та антибіотичну активність штаму 27952-2 за умови його культивування в повноцінних середовищах, що містять альтернативні джерела вуглецю. Біосинтез антрациклінів у мутантів, стійких до інгібування їх росту підвищеною концентрацією глюкози (glr) менше підлягає глюкозній репресії, а у 17 % glr – мутантів зростає рівень синтезу антрациклінів.

4. Отримано і вивчено колекцію мутантів штаму 27952-2, стійких до рубоміцину (DNR^r), доксорубіцину (DXR^r) та хлорамфеніколу (CML^r). Встановлено, що у таких мутантів виникають зміни у стійкості до ряду антибіотиків та біосинтезі антрациклінів. У геномі DNR^r – мутантів виявлено хромосомні перебудови. Встановлено, що серед DNR^r- та НГ- індукованих CML^r – мутантів, доцільно вести пошук штамів з підвищеною продукцією DXR, тоді як DXR^r – мутанти перспективні для відбору штамів з підвищеною продукцією DNR та DXR.

5. Вперше встановлено, що ряд DNR^r – мутантів штаму 27952-2 здатні утворювати DXR з доданого DNR. Подібного ефекту можна досягнути шляхом введення генів cpx та dnrI (кодують C-14-гідроксилазу та активатор транскрипції) S. griseus IMET3339 в cкладі висококопійної рекомбінантної плазміди pIJ486 у штам 27952-2. Такий підхід також спричинює зростання рівня сумарного синтезу антрациклінів, DNR та DXR.

6. Вперше встановлено, що одним з механізмів стійкості штаму 27952-2 до DNR є його ферментативне перетворення з утворенням менш токсичної сполуки – DXR. Таке явище дозволило створити простий спосіб отримання більш цінного антибіотика DXR з його попередника DNR.

Публікації автора:

1. Л. П. Дубицька, В. О. Федоренко. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952, стійких до антрациклінових антибіотиків // Мікробіол. журн. –2001.- Т.63, №4. - С. 53-61.

2. Л. Дубицька, С. Заворотна, Б. Осташ, О.Громико, Л. Басілія, В. Федоренко. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC 29050 та Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952 // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2000. - Вип. 25. - С.49-60.

3. Федоренко В. О., Л.І. Басілія, К. О. Панькевич, Л. П. Дубицька, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, О. М. Громико, Г. Крюгель. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків - полікетидів // Бюл. ін-ту. сіль-госп. мікробіол. - 200. – №8 -С. 27 - 31.

4. Дубицька Л. П., Федоренко В. О. Спосіб отримання штамів Streptomyces peucetius subsp. caesius з підвищеними синтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин // Проблеми винахідництва та раціоналізаторства в Україні. – 2001. - С. 64 - 67.

5. Дубицька Л. П., Федоренко В. О. Характеристика мутантів штаму Streptomyces peucetius subsp. сaesius ATCC 27952-2, стійких до хлорамфеніколу // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2002. - Вип.28. - С.105 - 113.

6. Дубицька Л. П., Федоренко В. О. Конструювання штамів Streptomyces рeucetius subsp. сaesius ATCC 27952-2 з підвищеною здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин // Біополімери і клітина. - 2002. - Т18,№2. - С. 91 - 95.

7. L. P. Dubitcka The isolation and characterization of doxorubicin overproducing strains of Streptomices peucetius subsp. сaesius ATCC 27952-2 // Molecular genetics, genetics of microorganisms and higher eucariotes. – 2001. - P. 88.

8. L. P. Dubitcka The creation the strains of Streptomyces peucetius with high level of doxorubicine production by the cloning of the cpx and dnrI genes of Streptomyces griseus into those strains // Conference on genetics and molecular biology. – 2000. - P.49.

9. L.P. Dubitcka. The isolation and characterization of antracycline overproducing strains of Streptomyces peucetius subspecius caesius ATCC 27952 by the rational selection aproach // 9^thEMSA International Scientific Symposium. – 2000. - C. 120.