Анотація до роботи:

Броварська О.С. Ліпополіцукриди та позаклітинні глікополімери Ralstonia solanacearum: склад, структура і біологічна активність. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню ліпополіцукридів (ЛПЦ) Ralstonia solanacearum. З семи штамів R. solanacearum ІСМР 750, 6524, 7859, 8115, 7864, 8169, 6189 виділені ЛПЦ, проведена хімічна ідентифікація, яка свідчить, що вони містять всі характерні для цих біополімерів компоненти. За складом диференцюючих для ліпідів А жирних кислот, 6 досліджуваних штамів можна віднести до одного хемотипу: вони містять 3-OH-C_14:0 і 2-OH-C_16:0. Відрізнявся від них R. solanacearum шт. 6189, в ліпіді А якого домінуючою була ізо-пентадеканова (іС_15:0), а з оксикислот присутня лише 2-ОН-С_16:0. Встановлено, що структури О-специфічного поліцукриду (О-ПЦ) штамів 6524 і 7859 характеризувались лінійними тетрацукридними ланцюгами, що повторювалися, і включали три залишки a-L-рамнози та один залишкок N-ацетилглюкозаміна. В деградованому ЛПЦ шт. 7859 виявлено наявність двох високомолекулярних фракцій О-ПЦ. Вивчення їх структури методом ЯМР-спектроскопії свідчить про їх ідентичність, тобто два О-ПЦ різнились молекулярною масою, тобто кількістю ланцюгів, які повторюються. Досліджувані ЛПЦ були токсичними і пірогенними. При модифікації ЛПЦ відбулася втрата ендотоксичної активності, зокрема токсичності і пірогенності. В дослідах подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні ЛПЦ R. solanacearum в гомологічних системах проявили активність антигену, а в гетерологічній – виявлена наявність перехресних серологічних реакцій у штамів R. solanacearum, які характеризуються як однаковими структурами О-ПЦ (8115, 750, 6524, 7859), так і такими, що відрізняються (7864, 8169, 5712). Встановлено, що дефосфорилювання, дезацилювання не впливає на серологічну активність ЛПЦ, в той час як сукцинилювання приводить до її втрати.

Порівняльне вивчення фітотоксичної дії культуральних рідин (позбавлених клітин) R. solanacearum на проростання і розвиток насіння показало, що найбільшу активність проявляють штами 6524 і 6189. Позаклітинні глікополімери (ГП) містили як білок, так і вуглеводи. Фітотоксична дія спостерігалась у заряджених ГП, домінуючими моноцукридами яких були рамноза, глюкоза і маноза.

Ключоів слова: Ralstonia solanacearum, ліпополіцукрид, О-специфічний поліцукрид, олігоцукрид кору, ліпід А, токсичність, пірогенність, модифікований ЛПЦ, позаклітинні глікополімери.

У дисертаційній роботі вирішено актуальну наукову задачу щодо вивчення закономірностей складу, будови, імунохімічної і біологічної ативності ЛПЦ і позаклітинних глікополімерів у представників фітопатогенного виду R. solanacearum. Обґрунтовано застосування методів хімічної модифікації ЛПЦ для зміни ендотоксичних властивостей, зокрема втрати токсичності і пірогенності. Головні наукові результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Вперше виділено і хімічно охарактеризовано ЛПЦ семи досліджуваних штамів R. solanacearum. Показано, що архітектоніка їх макромолекули є типовою для даного класу біополімерів і включає ліпід А, олігоцукрид кору і О-специфічний поліцукрид.

2. Вивчення складу і будови ЛПЦ R. solanacearum і його структурних компонентів свідчить, що дивергенція властивостей відбувається в наступному порядку: ліпід А / О-ПЦ – олігоцукрид кору. В ліпіді А виявлено два хемотипи: шість штамів R. solanacearum характеризуються однаковим набором жирних кислот, зокрема 3-ОН-С_14:0 і 2-ОН-С_16:0, в той час як ліпід А R. solanacearum шт. 6189 характеризувався відсутністю 3-ОН-С_14:0. По моноцукридному складу до двох хемотипів відносяться також О-ПЦ: домінуючими моноцукридами першого хемотипу є рамноза, глюкозамін, ксилоза і глюкоза, в той час як другого – галактоза, глюкоза, рамноза і фукоза. На рівні складу ОГ-кору досліджувані штами R. solanacearum складають більш гетерогенну групу – виявлено чотири хемотипи, які відрізняються вмістом окремих компонентів.

3. Встановлено, що О-ПЦ R. solanacearum шт. 7859 і 6524 характеризуються регулярною структурою і побудовані з лінійних тетрацукридних ланцюгів, які включають три залишки -L-рамнози і один залишок N-ацетилглюкозаміну.

4. Не виявлено залежності між структурою О-специфічних поліцукридів ЛПЦ і належністю штаму до певного біовару, рослини-хазяїна, з якої він був виділений, чи географічної зони, з якої він походить.

5. Показано, що ЛПЦ деяких штамів R. solanacearum містять загальні антигенні детермінанти: виявлена наявність перехресних серологічних реакцій у штамів R. solanacearum, які характеризуються як однаковими структурами О-ПЦ (штами 8115, 750, 6524, 7859), так і такими, що відрізняються (штами 7864, 8169, 5712).

6. Встановлено, що ЛПЦ R. solanacearum проявляють токсичність на два порядки нижчу, ніж ЛПЦ E.coli O55:B5, і пірогенність, нижчу (штами 7859, 8169, 6189) або вищу (штами 8115, 6524) в порівнянні з “Пірогеналом” – фармацевтичним препаратом.

7. Вперше одержано модифікований внаслідок утворення координаційної сполуки з діоксидом германію ЛПЦ, який в значній мірі втрачає токсичність, але зберігає інтерфероногенну активність. Показано, що модифікація ЛПЦ шляхом сукцинилювання, дефосфорилювання і дезацилювання призводить до повної втрати таких ендотоксичних властивостей, як токсичність і пірогенність.

8. Вперше встановлено, що ацетилювання, дефосфорилювання і дезацилювання не впливає на серологічну активність ЛПЦ, в той час як сукцинилювання призводить до її втрати.

9. Вперше показано, що позаклітинні глікополімери R. solanacearum, домінуючими моноцукридами яких є рамноза, глюкоза і маноза проявляють фітотоксичну дію.

Публікації автора:

1. Варбанец Л.Д., Кочарова Н. А., Книрель Ю.А., Мурас В.А., Броварская О.С., Москаленко Н.В. Липополисахариды Pseudomonas solanacearum и Pseudomonas cichorii // Микробиол. журн. – 1990. – Т.52, №4. – С.27-30. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваних штамів, виділені ЛПЦ, проведені аналізи по вивченню їх хімічного складу).

2. Kocharova N.A., Knirel Y.A., Shashkov A.S., Nifant’ev N.E., Kochetchov N.K., Varbanets L.D., Moskalenko N.V., Brovarskaya O.S., Muras V.A., Young J.M. Studies of O-specific polysaccaride chains of Pseudomonas solanacearum lipopolysaccharides consisting of structurally different repeating units // Carbohydr. Res. – 1993. – Vol.250. – P.275-287. (Мета роботи авторами сформульована спільно, здобувачем деградовані ЛПЦ та отримані їх структурні компоненти).

3. Варбанец Л.Д., Мурас В.А., Москаленко Н.В., Броварская О.С., Житкевич Н.В. Внеклеточные гликополимеры Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al., 1992) // Микробиол. журн. – 1996. – Т.58, №1. – С.30-36. (Здобувачем одержані позаклітинні глікополімери, отримані фракції нейтральних і заряджених глікополімерів, проаналізовано хімічний склад).

4. Varbanets L.D., Gvozdyak R.І., Brovarskaya O.S., Zhitkevich N.V. Bacterial glycopolymers: chemical characterization and phytotoxic activity //International regional seminar. Environment protection: modern studies in ecology and microbiology. Uzgorod. May 13-16, 1997. P.136-139 (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ліпополіцукрид, вивчений його моноцукридний і амінокислотний склад).

5. Варбанец Л.Д., Гвоздяк Р.И., Мурас В.А., Броварская О.С., Житкевич Н.В. Химический состав и биологическая активность гликополимеров Ralstonia solanacearum (Yabuuchi et al. 1995) // Микробиол. журн. – 1997. – Т.59, №5. – С.13-21. (Здобувачем одержані позаклітинні глікополімери, отримано окремі їх фракції, проведена хімічна ідентифікація і визначена молекулярна маса).

6. Варбанец Л.Д., Сейфуллина И.И., Рыбалко С.Л., Дядюн С.Т., Броварская О.С. Биологическая активность липополисахарида Ralstonia solanacearum ICMP 7859 и его модифицированного производного // Микробиол. журн. – 1998. – Т.60, №4. – С.80-87. (Авторами спільно сформульовано мету, здобувачем виділений ліпополіцукрид, отримані структурні компоненти, вивчений хімічний склад, досліджено токсичність нативного і модифікованого ліпополіцукридів).

7. Варбанец Л.Д., Гвоздяк Р.И., Мурас В.А. Броварская О.С., Житкевич Н.В. Характеристика липополисахарида Ralstonia solanacearum ICMP 6189 // Микробиол. журн. – 1998. – Т.60, №4. – С.15-24. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ліпополіцукрид, вивчений його хімічний склад).

8. Варбанец Л.Д., Васильев В.Н., Броварская О.С. Характеристика липополисахаридов Ralstonia solanaceatum // Микробиология. – 2003. – Т.72, №1. – С.19-25. (Здобувачем деградовані ліпополіцукриди та отримані їх структурні компоненти, вивчений хімічний склад О-специфічного поліцукриду, олігоцукриду кору та визначений жирнокислотний склад ліпіду А).

9. Броварська О.С., Варбанець Л.Д. Характеристика ліпополіцукриду Ralstonia solanacearum ICMP 8115 // Зб. статей учасників Міжнародної наукової конференції по фітопатогенним бактеріям. Київ. 2005. – С.107-112. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ліпополіцукрид його структурні компоненти, вивчений жирнокислотний склад).

10. Броварская О.С., Варбанец Л.Д. Липополисахарид Ralstonia solanacearum ICMP 8115: характеристика и эндотоксическая активность //Современные проблемы токсикологии. 2006. – №.4. – С.56-59. (Здобувачем сформульовано завдання роботи, проведені експериментальні дослідження по вивченню токсичності та пірогенності ліпополіцукридів).

11. Броварська О.С. Виділення і характеристика ліпополіцукридів Ralstonia solanacearum //Науковий вісник НАУ. – 2007. – Вип.105. – С.52-58.

12. Varbanets L.D., Rybalko S.L., Dyadun S.T., Brovarskaya O.S. Biological activity of modified Ralstonia solanacearum lipopolysaccharide // European Cytokine Network. – 1998. – Vol.9, №3. – P.437.

13. Varbanets L.D., Brovarskaya O.S., Gvozdyak R.І., Zhitkevich N.V. The interrelation of the chemical characterization of Ralstonia solanacearum glycopolymers and their phytotoxic activity // 9 th International Congress. Molecular plant-microbe Interactions. – Amsterdam. 1999. – P.171.

14. Vasiliev V.N., Varbanets L.D., Brovarskaya O.S. Fatty acid composition of lipid A of Ralstonia solanacearum lipopolysaccharide // XVI International Symposium on Glycoconjugates. – Hague. 2001. – P.53.

15. Броварська О.С., Варбанець Л.Д. Ліпополіцукрид Ralstonia solanacearum ICMP 8115 // Тези доп. Міжнародної наукової конференції по фітопатогенним бактеріям. – Київ. 2005. – С.37.

16. Броварська О.С., Васильєв В.М. Біологічна активність модифікованого ліпополіцукриду Ralstonia solanacearum // Тези доп. IX Українського біохімічного з’їзду. – Харків. 2006. – С.33.