Анотація до роботи:

Федірко Н.В. Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин. Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена аналізу механізмів підтримання гомеостазу Са²⁺ у клітинах підщелепної слинної залози в нормі та при патології. Виявлено, що параметри АХ-індукованого підвищення [Ca²⁺]_i визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са²⁺ з ЕР, входу Са²⁺ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР. Мітохондрії (МХ) регулюють АХ-індуковане вивільнення Са²⁺ з ЕР, попереджуючи Са²⁺-залежну інактивацію InsP₃ рецепторів. Доведено наявність функціонально активних Р1 та Р2 пуринорецепторів. Активація Р1 рецепторів призводить до потенціації АХ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів за рахунок цАМФ-залежної модуляції ФЛЦ–InsP₃ шляху. Вперше доведено наявність функціонально активних RyR, причому Са²⁺, який вивільняється з них, захоплюється в основному МХ, тоді як Са²⁺-АТФази ПМ та ЕР відповідають за форму [Ca²⁺]_i сигналу. Виявлено пасивний витік Са²⁺ з ЕР через транслоконовий комплекс. Вперше виявлено, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са²⁺. Виявлено зміни гомеостазу Са²⁺ у клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету: зростання [Са²⁺]_і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів та зниження активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз Са²⁺ кальцію в ЕР та МХ ацинарних клітин. Загалом, підтримання Са²⁺ гомеостазу забезпечується взаємодією Са²⁺-регулюючих систем ПМ, ЕР та МХ, порушення роботи яких є причиною розвитку патологій слинних залоз.

У представленій роботі відповідно до поставленої мети та завдань дослідження проведено комплексний аналіз механізмів підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у нормі та при експериментально викликаному цукровому діабеті. З одержаних результатів зроблено наступні висновки:

1. Природній медіатор парасимпатичної нервової системи АХ незалежно від концентрації викликає глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення [Ca²⁺]_i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів атропіном. Амплітудно-часові параметри [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са²⁺ із внутрішньоклітинних депо, надходження Са²⁺ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР Са²⁺-АТФазою вже під час висхідної фази [Ca²⁺]_і транзиєнту.

2. Важлива роль у регуляції процесу АХ-індукованого вивільнення Са²⁺ з ЕР належить МХ, які попереджують Са²⁺-залежну інактивацію InsP₃ рецепторів за механізмом позитивного зворотного зв’язку, що можливо завдяки їх просторовій колокалізації з ЕР, яку показано методом електронної мікроскопії.

3. У ПМ ацинарних клітин підщелепної слинної залози наявні функціонально активні пуринорецептори Р1 та Р2 типів. Активація Р1 рецепторів аденозином не призводить до змін [Ca²⁺]_і, проте супроводжується потенціацією [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, в основі якої лежить цАМФ-залежна модуляція ФЛЦ–InsP₃ сигнального шляху, оскільки цей ефект відтворюється за умов прямої активації АЦ. Активація Р2 рецепторів АТФ викликає [Ca²⁺]_і транзиєнти з ЕС₅₀=136±36 мкМ. Природа АТФ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів переважно іонотропна, а вклад метаботропних Р2Y рецепторів складає ~ 35%.

4. Шляхом прямої реєстрації амплітудно-часових змін концентрації іонізованого Ca²⁺ всередині ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози вперше показано, що як АХ, так і екзогенний ІnsР₃ викликають транзиєнтне вивільнення Са²⁺ з ЕР, яке повністю пригнічується блокатором ІnsР₃ рецепторів – гепарином. ІnsР₃-чутливе вивільнення Са²⁺ із ЕР дзвоноподібно залежить від Са²⁺ з максимумом в межах його фізіологічних концентрацій у цитоплазмі (100-400 нМ), потенціюється АТФ у низьких (<1 мМ) концентраціях і пригнічується – у високих. Кофеїн модулює ІnsР₃-чутливе вивільнення Са²⁺ із ЕР шляхом конкуретної взаємодії з АТФ-зв’язуючим центром молекули рецептора.

5. Вперше показано вклад ріанодинових рецепторів у [Ca²⁺]_i сигналізацію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Активація ріанодинових рецепторів кофеїном призводить до транзиєнтного зменшення [Ca²⁺]_ЕР (ЕС₅₀=7,3±1,1 мМ), яке блокується ріанодином, дзвоноподібно залежить від Са²⁺ (з максимумом при 100 нМ), однак не супроводжуться виникненням генералізованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів в інтактних клітинах. Це зумовлено швидким захопленням Са²⁺, який вивільняється із ріанодинових рецепторів, мітохондріями та частково Са²⁺-АТФазами EР чи ПМ. Шляхом прямої реєстрації [Ca²⁺]_ЕР, [Ca²⁺]_i та методом електронної мікроскопії одержано докази колокалізації ріанодинових рецепторів, мітохондрій та Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР.

6. Вперше доведено наявність постійного пасивного витоку Са²⁺ із ЕР ацинарних клітин, який за фізіологічних умов компенсується рівноважним захопленням кальцію Са²⁺-АТФазою ЕР. Пасивне вивільнення Са²⁺ не опосередковується ІnsР₃ та ріанодиновими рецепторами, або реверсивним режимом роботи Са²⁺-АТФази, а здійснюється через транслоконовий комплекс мембрани ЕР.

7. Депо-керований вхід Са²⁺ є основним шляхом надходження Са²⁺ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози, активація якого відбувається незалежно від способу спустошення депо ЕР (InsP₃-залежного чи InsP₃-незалежного). Амплітуда депо-керованого входу Са²⁺ пропорційна мірі спустошення ЕР, а однакова кінетика розвитку депо-керованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів незалежно від способу спустошення ЕР свідчить про єдиний механізм їх виникнення.

8. Вперше показано, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са²⁺, здійснюючи контроль за станом депо-керованих каналів ПМ шляхом попередження їх Са²⁺-залежної інактивації за механізмом позитивного зворотного зв’язку. Блокування Са²⁺-уніпортеру мітохондрій призводить до пригнічення входу Са²⁺ як у випадку InsP₃-незалежного, так і InsP₃-чутливого способу спустошення депо. Блокування захоплення Са²⁺ мітохондріями при InsP₃-чутливому спустошенні ЕР викликає більш виражене пригнічення депо-керованого входу Са²⁺, що відображає як регуляцію мітохондріями безпосередньо каналів ПМ, так і додатково InsP₃ рецепторів. Така регуляція можлива завдяки просторовій локалізації мітохондрій безпосередньо під ПМ та оточених ламелами ЕР, що показано методом електронної мікроскопії.

9. Вперше показано, що транс-мітохондріальне переміщення Са²⁺ є необхідним для підтримання депо-керованого входу Са²⁺ та процесу перезаповнення депо ЕР. Вклад МХ в перезаповнення депо ЕР залежить від тривалості стимуляції клітин. За умов спустошенння ЕР короткочасною дією АХ, його перезаповнення здійснюється, в основному, за рахунок прямого захоплення Ca²⁺ в EР і, додатково, за рахунок транс-мітохондріального транспорту Са²⁺. За умов тривалої стимуляції клітин, депо-керований вхід Са²⁺ здійснюється лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюють Са²⁺ з-під вустя SOC каналів. Кальцій, захоплений МХ, після транс-мітохондріального переміщення вивільняється до ділянок його захоплення Са²⁺-АТФазою ЕР, що і відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP₃.

10. В експериментах по визначенню параметрів слиновиділення in vivo виявлено, що у щурів із СТЗ-індукованим діабетом істотно знижується швидкість слиновиділення, активність амілази та концентрація білка слини порівняно до таких у контрольних тварин.

11. Вперше виявлено зміни гомеостазу кальцію у ацинарних клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету. Показано зростання [Са²⁺]_і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів до АХ та КХ та зниження активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР. Виявлені зміни є причиною розвитку цитоплазматичної кальцієвої перегрузки та сповільненої кінетики спаду [Са²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів.

12. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз кальцію у Са²⁺ депо таких як ЕР та МХ. Показано зменшення вивільнення Са²⁺ із ЕР незалежно від механізму його активації (агоніст-, ІnsР₃- чи кофеїн-індукованого, або рецептор-незалежного). Також виявлено зростання пасивного вивільнення кальцію через транслоконову пору ЕР. Виявлені зміни свідчать про зменшення кількості Са²⁺ в ЕР. За умов діабету виявлено відсутній у здорових тварин шлях пасивного вивільнення Са²⁺ із мітохондрій, опосередкований порою перемінного проникнення. Комплекс змін кальцієвого гомеостазу, виявлений нами в мітохондріях та ЕР, є найбільш ймовірною причиною пригнічення процесів синтезу та секреції компонентів слини при діабеті.

13. Загалом, одержані дані свідчать про те, що підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітин підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок комплексної взаємодії між Са²⁺-регулюючими системами ПМ, ЕР та мітохондрій. Взаємодія між Са²⁺-регулюючими системами здійснюється за рахунок процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки їх просторової колокалізації. Порушення функціонування систем підтримання гомеостазу кальцію є ймовірною причиною розвитку патологічних станів слинних залоз.