Анотація до роботи:

Лінецька М.В. "Механізми реалізації дії альфа-латротоксину як стимулятора нейросекреції". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено з'ясуванню механізму вивільнення нейромедіатора з нервових закінчень головного мозку щурів, індукованого -латротоксином (-LTX) - основним компонентом отрути павука каракурта. Досліджено механізм дії токсину за наявності або відсутності позаклітинного Са²⁺. Показано участь двох пулів ГАМК – везикульованого та цитозольного – в реалізації секретогенної дії -LTX. З'ясовано, що механізм дії -LTX певною мірою залежить від концентрації токсину: у високій концентрації він значно ефективніше стимулює вихід нейромедіатора із невезикульованого пулу. Вперше одержані дані щодо участі ГАМК-переносника плазматичної мембрани у вивільненні ГАМК під дією a-LTX.

1. a-Латротоксин завдяки своїй здатності стимулювати потужне вивільнення нейромедіаторів з пресинаптичних нервових закінчень є широко вживаним інструментом для фундаментальних досліджень нейросекреції. Особливий інтерес викликає секретогенна дія a-LTX в середовищі без Са²⁺. Гостро дискусійним є питання щодо здатності токсину залучати до секреторного процесу цитозольний (невезикульований) пул нейротрансмітерів, а також щодо того, як реалізується така дія токсину. Розв'язання цієї проблеми вимагає застосування нових методичних підходів.

2. Показано, що -LTХ здатен специфічно стимулювати процес екзоцитозу у вільному від Са²⁺ середовищі за умов виснаження цитозольного пулу ГАМК внаслідок пермеалізації синаптосом дигітоніном.

3. З використанням конкурентних інгібіторів транспортера ГАМК (ніпекотинової кислоти та 2,4-діамінобутирату), які модулюють вміст ГАМК у цитозольному пулі шляхом гетерообміну, продемонстрована здатність -LTХ стимулювати вивільнення ГАМК за рахунок не лише активації екзоцитозу, але і залучення вільного цитозольного нейромедіатора

4. Досліджено секретогенну дію a-LTX за умов модулювання процесу екзоцитозу інгібіторами протеїнфосфатаз. Показано, що окадаєва кислота (інгібує ПФ 1 та 2А) та циклоспорин А (інгібує ПФ 2В) посилюють стимулювальну дію a-LTХ. Чутливість до циклоспорину А знижується із зростанням використаної концентрації -LTХ (тобто із залученням цитозольної ГАМК до процесу секреції). Водночас, окадаєва кислота помітно пригнічує секретогенний ефект 4-амінопіридину, а циклоспорин А, навпаки, його підвищує. Отже, механізми нейросекреції, викликаної токсином і 4-АП, певним чином відрізняються.

5. Вивчено дію a-LTX за умов інгібування ФІ-4-кінази (важливої для здійснення екзоцитозу) феніларсен оксидом. Показано, що ФАО відчутно пригнічує секрецію, стимульовану субнаномолярним a-LTX, або у разі дії токсину на синаптосоми з виснаженим цитозольним пулом ГАМК (у цих випадках дія a-LTX реалізується шляхом екзоцитозу). Дія високих концентрацій a-LTX, які спричиняють не лише стимуляцію екзоцитозу, мало чутлива до ФАО. Залежність ступеню інгібування секреторного процесу від концентрації a-LTX - ще одне свідчення здатності токсину індукувати різні шляхи вивільнення нейромедіатора.

6. Вивчено, як впливає перерозподіл ГАМК між везикульованим і цитозольним пулами на розвиток секретогенної дії a-LTX. Показано, що внаслідок виснаження везикул протонофором FCCP (в середовищі без Са²⁺) або бафіломіцином А₁ (в присутності та відсутності Са²⁺) відбувається зникнення або пригнічення першого швидкого (перші 2 хв) та значне посилення пізнішого етапу (на 5-10 хв) секреторної дії a-LTX (як у низькій, так і у високій концентрації). Це свідчить про залучення різних механізмів вивільнення ГАМК на різних етапах розвитку процесу: екзоцитозу на першому етапі та витікання ГАМК із цитозолю - на другому.

7. Вперше одержані прямі докази участі ГАМК-транспортера плазмалеми у вивільненні ГАМК під дією a-LTX. Продемонстровано, що блокування транспорту ГАМК несубстратним інгібітором NO-711 пригнічує другий етап розвитку секретогенної дії токсину. Отже, саме на пізнішому етапі відповіді синаптосом відбувається залучення a-латротоксином цитозольного пулу ГАМК, а її вихід із цитозолю відбувається (принаймні частково) шляхом оберненої роботи переносника ГАМК.

Публікації автора:

1. Storchak L.G., Kravchuk (Linetska) M.V., Himmelreich N.H. Ocadaic acid and cyclosporin A modulate [³H]GABA release from rat brain synaptosomes // Neurochemistry Int. - 2001. - Vol. 38. - P. 445-451.

2. Linetska М.V., Storchak L.G., Himmelreich N.H. Does extracellular calcium determine what pool of GABA is the target for a-latrotoxin? // Neurochemistry Int. - 2002. - Vol. 40. - P. 387-395.

3. Лінецька М.В., Сторчак Л.Г., Гіммельрейх Н.Г. Вплив виснаження цитозольного пулу [³H]ГАМК у синаптосомах на секретогенну дію a-латротоксину // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74. - №3. - С. 65-73.

4. Linetska М.V., Storchak L. G., Himmelreich N. H. Phenylarsine oxide inhibits alpha-latrotoxin-stimulated [³H]GABA release from rat brain synaptosomes. - Neurochemistry Int. - 2003. - Vol. 42. - №7. - P. 583-590.

5. Linetska М.V., Storchak L.G., Tarasenko A.S., Himmelreich N. H. Involvement of membrane GABA transporter in a-latrotoxin-stimulated [³H]GABA release // Neurochemistry Int. - 2004. - Vol. 44. - P. 303-312.

6. Kravchuk (Linetska) M.V. and Storchak. L.G. A phosphatase 2B inhibitor, cyclosporin A, potentiates a-latrotoxin-induced [³H]GABA release from the rat brain synaptosomes // Neurophysiology. - 2000. - Vol. 32. - N 2/3. - P. 199.

7. Linetska M.V., Storchak L.G., Himmelreich N.H. Depolarization- and a-latrotoxin-induced [³H]GABA release from the rat brain synaptosomes: effect of phenylarsine oxide // Neurophysiology. - 2002. - Vol. 34. - N 2/3. - P. 187.

8. Linetska M.V., Storchak L.G., Himmelreich N.H. Phenylarsine oxide inhibits exocytotic [³H]GABA release from the rat brain synaptosomes / Thesis of the 4^th Parnas Conference, September 15-18, 2002, Wroclaw. - P. 50.

9. Лінецька М.В., Сторчак Л.Г., Гіммельрейх Н.Г. Вивільнення [³H]ГАМК з синаптосом мозку щурів під впливом деполяризації та -латротоксину: ефект феніларсин оксиду // Укр. біохім. журн. / Спец. випуск "Матеріали VIIІ Укр. біохім. з'їзду 1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці" - 2002. - Т. 74. - N 4a (додаток 1). - С. 56.

10. Linetska М.V., Storchak L.G., Himmelreich N. H. Inhibitor of phosphatidylinosytol 4-kinase modulates depolarization- and a-latrotoxin-induced [³H]GABA release from rat brain synaptosomes // Abstracts of FEBS Lecture Course on Cellular Signaling & 4^th Dubrovnik Signaling Conference, Dubrovnik-Cavtat, May 21-27, 2004. - P. 98.

11. Linetska М.V., Storchak L.G., Himmelreich N. H. Plasma membrane GABA transporter is involved in alpha-latrotoxin-evoked [³H]GABA release // Abstract book of IBRO Advanced School of Neuroscience, Yalta, Crimea, Sept. 16-28, 2004. - P. 24.