Анотація до роботи:

Кухарський В.М. Місце та роль тирозинових протеїнкіназ родин Src і Syk в передачі внутрішньоклітинних сигналів за участю мікротрубочок в процесі нейрональної диференціації. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11. – цитологія, клітинна біологія, гістологія – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.

У дослідженнях, проведених на моделі нейрональної диференціації, основаній на індукції клітин ембріональної карциноми миші ретиноєвою кислотою здійснено детальну хронологічну характеристику морфологічних та біохімічних змін клітин під час нейронального диференціювання. З’ясовано, що ферменти родини Src вносять значний вклад у фосфорилювання білків по залишках тирозину під час процесів нейрональної диференціації. Проведений порівняльний аналіз експресії основних нейрональних маркерних білків при дії РР2 - інгібітора тирозинкіназ родини Src свідчить про стримуючу дію щодо нейрогенезу тирозинкіназ родини Src. Реконструйовано картину експресії білків Src, Fyn, Lyn і Syk в процесі нейрогенезу, а також їх розподіл у розчинній та нерозчинній (збагаченій мікротрубочками) фракціях, проаналізовано розмір розчинних білкових комплексів, які містять білки Src і Syk. Показано асоціацію тирозинкіназ Src, Fyn і Syk з тубулінами під час нейрональної диференціації та зростання рівнів їх фосфорилювання. Виявлено субстрати кіназ родини Src в -тубулінових комплексах.

У дисертації, відповідно до поставленої мети, вирішене актуальне наукове питання, що стосується участі нерецепторних ТК родин Src та Syk в регуляції процесів нейрональної диференціації, клітин Р19 та зроблені наступні висновки:

1. Встановлено, що процес нейрогенезу в культурі клітин ембріональної карциноми миші Р19, індукованих ретиноєвою кислотою, характеризується закономірними змінами експресії маркерних білків (ІІІ-тубуліна, ацетильованого тубуліна і БАМ-2с) та тирозинкіназ (Src, Fyn, Lyn і Syk). Рівень експресії білків Src і Fyn зростає, а рівень експресії тирозинкінази Lyn спочатку зростає, а потім спадає. Одночасно рівень експресії білка Syk спочатку спадає, а згодом зростає, перевищуючи початковий рівень.

2. В ході нейрогенезу клітин Р19 відбувається зміна кількісних співвідношень тирозинкіназ Src, Fyn і Syk на користь нерозчинної фракції клітин, збагаченої стабільними мікротрубочками, і не зафіксовано суттєвої зміни співвідношень білка Lyn між розчинною та нерозчинною фракціями клітин.

3. Тирозинкінази родини Src вносять суттєвий вклад у загальний рівень фосфорилювання білків клітин Р19 по залишках тирозину під час їх нейрональної диференціації. Рівень Src-залежного фосфорилювання білків зростає в процесі ранніх стадій нейрогенезу цих клітин.

4. Інгібування активності тирозинкіназ родини Src інгібітором РР2 призводить до сповільнення процесу нейрональної диференціації клітин Р19, індукованих ретиноєвою кислотою.

5. Встановлено, що частина тирозинкіназ Src і Syk знаходиться у розчинних білкових цитоплазматичних комплексах з масою від 100 до 400 кДа. Маса білкових комплексів, які містять білок Syk, зростає в процесі диференціації клітин, що свідчить про ускладнення надмолекулярної структури цих комплексів.

6. У клітинах Р19 -тубулін перебуває в розчинних комплексах з білками Fyn, Src та Syk. Вміст цих тирозинкіназ у комплексах з -тубуліном зростає упродовж ранніх стадій нейронального диференціювання. При цьому на дев’ятий день диференціювання клітин білки Src і Fyn знаходяться у фосфорильованому по залишках тирозину стані. Одночасно в ході нейрогенезу у складі розчинних комплексів з білками Src і Syk з’являється -тубулін.

7. У диференційованих клітинах Р19 у комплексах з -тубуліном знахо-дяться кілька субстратів тирозинкіназ родини Src (молекулярною масою біля 75, 65, 60 і 50 кДа), які перебувають у фосфорильованому стані.

8. Таким чином встановлено, що у регуляції механізмів нейронального диференціювання клітин Р19 беруть участь тирозинкінази Src, Fyn і Syk, передаючи внутрішньоклітинні регуляторні сигнали до системи мікротрубочок, зокрема до комплексів -тубуліну, в яких знаходяться специфічні субстрати цих тирозинкіназ.

Публікації автора:

1. Кухарський В.М., Драберова Є., Блюм Я.Б., Draber P. З'ясування ролі тирозинкінази Syk під час нейрональної диференціації клітин ембріональної карциноми миші Р19, індукованої ретиноєвою кислотою //Біополімери і клітина.-2003.-Vol.19, № 5.-P.445-451. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка матеріалів до друку; Співавтори: Draberova E. – культивування культури клітин, імунофлюоресцентна і диференційно-контрастна мікроскопія; Блюм Я.Б. – керівництво роботою, редагування; Draber P. – загальне керівництво експериментальною роботою).

2. Кухарський В.М., Draberova E., Блюм Я.Б., Draber P. Утворення комплексів тирозинкінази SYK з білками мікротрубочок під час нейрональної диференціації клітин ембріональної карциноми миші Р19 //Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології.-2003.-Vol.47, № 1.-P.29-39. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка матеріалів до друку; Співавтори: Draberova E. – культивування культури клітин; Блюм Я.Б. – керівництво роботою, редагування; Draber P. – загальне керівництво експериментальною роботою).

3. Kukharskyy V., Sulimenko V., Macurek L., Sulimenko T., Draberova E., Draber P. Complexes of gamma-tubulin with nonreceptor protein tyrosine kinases Src and Fyn in differentiating P19 embryonal carcinoma cells //Exp.Cell Res.-2004.-Vol.298, № 1.-P.218-228, On-line 10.05.2004, www.sciencedirect.com. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів; Співавтори: Sulimenko V. – проведення двовимірного електрофорезу білків; Macurek L. – випробовування з GST білком; Sulimenko T. – обробка екстрактів лужною фосфатазою; Draberova E. – культивування культури клітин, імунофлюоресцентна мікроскопія; Draber P. – загальне керівництво роботою, підготовка матеріалів до друку, редагування).

4. Draberova E., Sulimenko V., Kukharskyy V., Draber P. Monoclonal antibody NF-09 specific for neurofilament protein NF-M //Folia Biol (Praha).-1999.-Vol.45, № 4.-P.163-165. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів; Співавтори: Draberova E. – культивування культури клітин, імунофлюоресцентна мікроскопія; Sulimenko V. – приготування екстрактів мозку; Draber P. – загальне керівництво роботою, підготовка матеріалів до друку, редагування).

5. Blume Ya., Yemets A., Kukharskyy V., Sulimenko V., Draberova E., Draber P. Protein phosphorylation on tyrosines as common mechanism of plant and animal microtubule regulation // International symposium “Intracellular signalling in plant and animal systems”.- Kyiv.- 2001.-P.37. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження на культурі клітин Р19, статистична обробка та аналіз результатів, доповідь; Співавтори: Blume Ya. – загальне керівництво роботою, редагування; Yemets A. – визначення фосфорилювання білків рослин; Sulimenko V. – ізоелектричне фокусування білків; Draberova E. – культивування культури клітин, імунофлюоресцентна мікроскопія; Draber P. – загальне керівництво роботою, редагування).

6. Kukharskyy V., Draberova E., Blume Ya. Protein tyrosine kinases of SRC and SYK families during neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. // Conference for students, PhD students and young scientist. “Molecular biology and genetics” - Kyiv.-2001.- P.50. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів, стендова доповідь; Співавтори: Draberova E. – культивування культури клітин, імунофлюоресцентна мікроскопія; Blume Ya. – загальне керівництво роботою).

7. Kukharskyy V., Draberova E., Draber P. Protein-tyrosine kinases and tubulin complexes in differentiating P19 embryonal carcinoma cells. // IX. Cytoskeletal club.- Vranovska Ves, Czech Republic.- 2001. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів, приготування та проведення стендової доповіді; Співавтори. Draberova E. – культивування культури клітин, імунофлюоресцентна мікроскопія; Draber P. – загальне керівництво роботою, редагування).