Анотація до роботи:

Лиманський О.П. Модифікація та функціоналізація зондів і субстратів для нанобіотехнології. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеці-альністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН Ук-раїни, Київ, 2007.

Представлено експериментальні результати розробки та характеризації модифі-кованих та функціоналізованих біополімерами зондів та субстратів для атомно-си-лової мікроскопії (АСМ), а також результати досліджень внутрішньомолекулярної компактизації поодиноких молекул ДНК при іммобілізації на субстраті під впли-вом його поверхневих властивостей. Створено та охарактеризовано за допомогою АСМ у режимі силових вимірювань амінослюду (субстрат для іммобілізації біопо-лімерів) з регульованою гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду, а також аміномодифіковані і функціоналізовані біополімерами (ДНК, бичачим сироватко-вим альбуміном) АСМ-зонди. На основі АСМ-даних доведено, що ДНК представ-ляє своєрідну молекулярну пружину, яка може бути не тільки розтягнута, але й стиснута. Поряд з тягненими лінійними молекулами ДНК фага l та суперспіраль-ними ДНК pGEMEX (які характеризувалися відстанню між нуклеотидами вздовж осі спіралі H = 4,87 – 5,36 Е) візуалізовано поодинокі молекули з надзвичайно ви-соким рівнем компактизації, ступінь суперспіралізації яких значно вищий порівня-но з раніше досягнутими експериментально та розглянутими теоретично. Такі стиснуті суперспіральні молекули ДНК, які характеризувалися 1,94 Е < H < 2,19 Е, були віднесені до нової форми ДНК – S-ДНК. Встановлено, що молекули ДНК компактизуються до рівня сфероїдів через три етапи послідовного складання вдвічі із зменшенням довжини осі суперспіралі, тобто з утворенням осей суперспіралі другого та третього порядків.

У дисертації наведено нове вирішення наукової проблеми створення для дослід-

жень у галузі нанобіотехнології амінозондів (як компонентів біосенсорів) та аміно-слюди з заданими поверхневими властивостями (як субстрату для іммобілізації біополімерів) шляхом модифікації у газовій фазі. На основі узагальнення даних, отриманих за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ), полімеразної ланцю-гової реакції, шляхом розробки підходів до візуалізації та наноманіпулювання по-одинокими молекулами доведено, що ДНК, іммобілізована на амінослюді, є елас-тичною молекулою, яка може бути не тільки розтягнута, але й стиснута, а також компактизується до рівня сфероїдів через три етапи послідовного складання вдвічі.

1. Вперше розроблено технологію отримання амінослюди, субстрату для іммо-білізації біополімерів для досліджень за допомогою атомно-силової мікроскопії, з заданими властивостями – регульованою гідрофобністю та поверхневою щільніс-тю заряду. Поряд з відомою стандартною амінослюдою, отриманою модифікацією в парах аміносилану, за рахунок варіювання умов модифікації слюди отримано мо-дифіковану амінослюду як з підвищеною гідрофобністю та поверхневою щільніс-тю аміногруп, так і зі зменшеною порівняно із стандартною амінослюдою.

2. Вперше розроблено технологію отримання аміномодифікованих АСМ-зондів в газовій фазі на відміну від існуючого підходу аміномодифікації у розчині. За до-помогою АСМ в режимі силових вимірювань показано, що значення сили адгезії для пари поверхонь амінозонд – слюда (як і для пари стандартна амінослюда – зонд) зменшувались у ряду I = 10 мM Na⁺ I = 100 мM Na⁺ pH 11,2. Модифіко-вані амінозонди функціоналізовано через нековалентне зв’язування з ДНК та кова-лентну взаємодію з глютаральдегідом.

3. Розроблено схему функціоналізації АСМ-зондів протеїнами та проведено їх-ню функціоналізацію бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Модифіковані амінозонди з ковалентно приєднаним амінореакційним лінкером та БСА охаракте-ризовано шляхом силових вимірювань – визначено значення сили адгезії та роботи сили адгезії як після кожного етапу функціоналізації, так і тільки для зонда з при-єднаним БСА.

4. Розвинуто новий експериментальний підхід витягування молекул ДНК. Тяг-нуті лінійні молекули ДНК фага l та тягнуті суперспіральні молекули ДНК pGEMEX візуалізовані на поверхні амінослюди із зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю аміногруп. Визначене безпосередньо з АСМ-зображення збільшення контурної довжини тягнених ссДНК pGEMEX довжиною 3993 п.н. оз-начає, що молекули ссДНК витягнуто у 1,5-1,7 разу порівняно з В-формою ДНК, що призвело до зростання відстані між нуклеотидами вздовж осі спіралі до H = 4,87 – 5,36 Е.

5. Доведено, що ДНК являє собою своєрідну молекулярну пружину – молекула ДНК може бути не тільки витягнута, але й стиснута. На модифікованій амінослюді поряд з плектонемічно суперспіральними молекулами ДНК були візуалізовані по-

одинокі молекули з надзвичайно високим рівнем компактизації, ступінь суперспі-

ралізації яких значно вищий у порівнянні з раніше досягнутими експериментально

та розглянутими теоретично. Відстань між нуклеотидами вздовж осі спіралі для цих суперспіральних молекул ДНК змінювалася у діапазоні 1,94 Е < H < 2,19 Е. Такі стиснуті суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною міжнуклеотидною від-станню вздовж осі дуплекса порівняно з відомими формами ДНК віднесено до но-вої форми ДНК – S-ДНК, для якої визначений нахил основ та побудована модель. Важливо, що при цьому утворюються як ліві, так і праві надсуперспіральні ДНК.

6. Візуалізацією лінійних та суперспіральних молекул ДНК на чотирьох субст-ратах з різними поверхневими властивостями доведено, що стискування молекул ДНК обумовлено поверхневими властивостями субстрату – високою гідрофобніс-тю та щільністю заряду модифікованої амінослюди.

7. Вперше візуалізовано етапи компактизації поодиноких молекул суперспіраль-ної ДНК pGEMEX, іммобілізованих на модифікованій амінослюді. Показано, що компактизація поодиноких молекул відбувається через три етапи послідовного складання навпіл із зменшенням довжини осі суперспіралі, тобто з утворенням осей суперспіралі другого та третього порядків.

8. Вперше візуалізовані напівсфероїди та сфероїди – структури, утворені пооди-нокими суперспіральними молекулами ДНК, – та показано, що тороїди також мо-жуть бути утворені поодинокими молекулами ДНК. На основі аналізу отриманих зображень запропоновано модель можливих конформаційних переходів суперспі-ральної ДНК in vitro за відсутності протеїнів при зростанні рівня компактизації ДНК. Компактизація поодиноких суперспіральних молекул ДНК обумовлена екра-нуванням негативно заряджених фосфатних груп ДНК, що взаємно відштовхують-ся, позитивно зарядженими аміногрупами амінослюди.

9. Показано, що новий метод характеризації субстратів, заснований на візуаліза-ції конформації плектонемічно суперспіральних молекул ДНК, є надзвичайно ін-формативним навіть порівняно з АСМ у режимі силових вимірювань, оскільки до-зволяє отримати додаткову інформацію про поверхневі властивості субстрату, на якому іммобілізовані молекули ДНК. Візуалізовано хрестоподібну структуру су-перспіральної ДНК pUC8 і показано, що розмір стебла її шпильки становить 11 пар нуклеотидів, а петля містить 4 нуклеотиди.

10. Візуалізовано РНК-транскрипти (у вигляді джгутоподібних конденсованих структур) та комплекси, що утворює РНК-полімераза (РНКП) бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею (яка містить промотор та термінатор транскрипції Т7 РНКП) в про-цесі транскрипції. Показано, що на одній молекулі ДНК-матриці 2-3 молекули Т7 РНКП одночасно утворюють як специфічні комплекси з кінцевими фрагментами ДНК-матриці, так і комплекси в області термінації та в процесі елонгації транск-рипції. Візуалізовані комплекси ДНК – Т7 РНКП з трьома молекулами білка на од-ній молекулі ДНК-матриці відповідають етапам ініціації, елонгації та термінації транскрипції.

Публікації автора:

1. Лиманский А.П. Визуализация крестообразной структуры суперспиральной ДНК посредством атомно-силовой микроскопии // Биофизика. – 2000. – Т. 45, № 6. – С. 1039-1043.

2. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Атомно-силова мікроскопія: від візуалізації молекул ДНК та клітин до вимірювання сили міжмолекулярних взаємодій // Биоло-гический вестник. – 2001. – Т. 5, № 1-2. – С. 124-132.

3. Лиманский А.П. Исследование аминомодифицированной слюды как субстрата для атомно-силовой микроскопии нуклеиновых кислот // Біополімери і клітина. – 2001. – Т. 17, № 4. – С. 292-297.

4. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Вивчення геномної ДНК мікроорганізмів ме-тодом атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2002. – Т. 36, № 4. – С. 30-36.

5. Limansky A., Shlyakhtenko L., Schaus S., Henderson E., Lyubchenko Y. Aminomodi-fied probes for atomic force microscopy // Probe Microscopy. – 2002. – Vol. 2, № 3-4. – Р. 227-234.

6. Лиманский А.П. Исследование аминомодифицированных зондов для атомно-си-ловой микроскопии биомолекул // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 1. – С. 62-70.

7. Лиманський О.П. Вивчення хрестоподібної структури суперспіральної ДНК плазміди pUC8 за допомогою атомно-силової мікроскопії та комп'ютерного моде-лювання // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 5. – С. 401-405.

8. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Візуалізація ціанобактерій у водному розчи-ні за допомогою атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2003. – Т. 37, № 1. – С. 68-71.

9. Лиманский А.П. Атомно-силовая микроскопия: от визуализации молекул ДНК и белков до измерения силы межмолекулярных взаимодействий // Успехи современ-ной биологии. – 2003. – Т. 123, № 6. – С. 531-542.

10. Лиманский А.П., Лиманская О.Ю., Волянский Ю.Л. Компьютерный анализ ин-

вертированных повторов в геноме микобактерий туберкулеза // Журнал микробио-логии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2004. – № 5. – С. 48-52.

11. Лиманський О.П. Надсуперспіралізація та компактизація суперспіральної ДНК

// Цитология и генетика. – 2005. – Т. 39, № 2. – С. 64-71.

12. Лиманська О.Ю., Лиманська Л.О., Лиманський О.П. S-форма ДНК – надсупер-спiральна макромолекула з ~ 2 Е вiдстанню мiж парами нуклеотидів вздовж осi

дуплекса // Біополімери і клітина. – 2005. – Т. 21, № 6. – С. 515-524.

13. Лиманский А.П. Визуализация ампликонов после проведения полимеразной цепной реакции // Биофизика. – 2005. – Т. 50, № 6. – С. 1019-1024.

14. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. S-форма ДНК – суперспиральная ДНК с 1.94 – 2.19 Е расстоянием между парами оснований вдоль оси дуплекса // Молекулярная биология. – 2006. – Т. 40, № 1. – С. 122-136.

15. Лиманська О.Ю., Лиманська Л.О., Лиманський О.П. Компактизацiя суперспi-ральної ДНК на модифiкованiй амiнослюдi // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 1. – С. 18-28.

16. Лиманський О.П. Аміномодифіковані зонди з ковалентно приєднаними молеку-лами для атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2006. – Т. 40, № 1. – С. 70-80.

17. Лиманский А.П. Функционализация аминомодифицированных зондов для атом-но-силовой микроскопии // Биофизика. – 2006. – Т. 51, № 2. – С. 225-235.

18. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспи-ральной ДНК, адсорбированных на аминослюде // Биоорганическая химия. – 2006. – Т. 32 , № 5. – С. 494-510.

19. Лиманський О.П. Візуалізація комплексу ДНК з Т7 РНК-полімеразою за допо-могою атомно-силової мікроскопії // Біополімери і клітина. – 2007. – Т. 23, № 1. – С. 3-13.

20. Лиманський О.П. Візуалізація комплексів РНК-полімерази бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею при елонгації транскрипції // Укр. біохім. журн. – 2007. – Т. 79, № 1. – С. 94-103.

21. Лиманський О.П. Візуалізація РНК-транскриптів за допомогою атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2007. – Т. 41, № 2. – С. 12-18.

22. Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспиральной ДНК, иммобилизованных на аминослюде: от дуплекса к минитороидальной и сфериче-ской конформации // Биофизика. – 2007. – Т. 52, № 2. – С. 252-260.

23. Пат. 13571Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб модифікації слюди, суб-страту для атомно-силової мікроскопії: Пат. 13571 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко С.С., Драч М.І., Лиманська Л.О., Клімов О.І. (Україна); Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. – № 200508247; Заявл. 22.08.2005; Опубл. 17.04.2006. – 14 с.

24. Пат. 17942 Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб витягнення лінійних та суперспіральних молекул ДНК: Пат. 17942 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко С.С., Драч М.І., Лиманська Л.О., Клімов О.І. (Україна); Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. – № 200604603; Заявл. 25.04.2006; Опубл. 16.10.2006. – 8 с.

25. Пат. 17981 Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб стиснення лінійних та суперспіральних молекул ДНК: Пат. 17981 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко Л.М., Кучма І.Ю., Лиманська Л.О., Пугач Н.Б. (Україна); Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. – № 200604883; Заявл. 03.05.2006; Опубл. 16.10.2006. – 8 с.

26. Limansky A., Limanskaya O., Kamensky Yu., Vovk O., Vashchenko L. Study of fulle-rene structure by scanning tunneling microscopy // Proc. 185^th Meeting of The Electro-chemical Society. – San Francisco (USA). – 1994. – P. 215-216.

27. Limansky A. Chemical force microscopy of aminomodified AFM tips and substrates // Proc. International Symp. “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Nanostructures”. – Tokyo (Japan). – 2001. – P. 85.

28. Limansky A. Imaging of cruciform structure in supercoiled DNA by atomic force microscopy // Proc. International Symp. “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Na-nostructures”. – Tokyo (Japan). – 2001. – P. 86.

29. Limansky A. Imaging of linear and supercoiled nucleic acids in air and cells in aque-

ous solution by atomic force microscopy // Конф. для молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики. – Київ (Україна). – 2001. – C. 106.

30. Lymanskiy A. Cruciform structure in supercoiled DNA: imaging by atomic force mic-roscopy and computer modeling // Proc. 8^th International Symp. on Molecular Aspects of Chemotherapy. – Gdansk (Poland). – 2001. – P. 192.

31. Lymanskiy A. Atomic force microscopy aminomodified tips and substrates for DNA immobilization // Proc. 8^th International Symp. on Molecular Aspects of Chemotherapy. – Gdansk (Poland). – 2001. – P. 193.

32. Limanskii A., Limanskaya O. Inverted repeats: computer analysis of microorganisms genome and imaging of cruciform structure in DNA by atomic force microscopy // Proc. SPIEs First International Symp. on Microtechnologies for the New Millennium. – Mas-palomas (Spain). – 2003. – Vol. 5119. – P. 337-348.

33. Limanskii A., Limanskaya O. Inverted repeats in microorganisms: comparison of two isolates of Mycobacterium tuberculosis with complete genome and visualization of cruci-form structure in plasmid DNA by atomic force microscopy // Proc. 1^st FEMS Congress of European Microbiologists. – Ljubljana (Slovenia). – 2003. – P. 442.

34. Limanskaya O., Limanskii A. Imaging of S-DNA – new DNA form with ~ 2 Е rise per base pair // Proc. 15^th IUPAB & 5^th EBSA International Biophysics Congress. – Mon-tpellier (France). – 2005. – P. 673.

35. Limanskaya O., Limanskii A. Compaction of single supercoiled DNA molecules on the modified amino mica // Proc. 15^th IUPAB & 5^th EBSA International Biophysics Con-gress. – Montpellier (France). – 2005. – P. 673.

36. Limanskaya O., Limanskii A. Imaging stretched and compressed supercoiled DNA // Proc. III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions. –

Kyiv (Ukraine). – 2006. – P. 124.

37. Limanskaya O., Limanskii A. Compaction of supercoiled DNA molecules into sphe-roids // Proc. III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interac-tions. – Kyiv (Ukraine). – 2006. – P. 125.

38. Limanskii A., Limanskaya O. Visualizing stretched and compressed single superco-iled DNA molecules // Proc. Optical Spectroscopy of Biomolecular Dynamics II. – Eilat (Israel). – 2006. – P. 64.

39. Limanskii A., Limanskaya O. Imaging compacted single supercoiled DNA molecules with different length of superhelix axis // Proc. Optical Spectroscopy of Biomolecular Dynamics II. – Eilat (Israel). – 2006. – P. 52.