Анотація до роботи:

Назарко Т.Ю. Молекулярні механізми деградації пероксисом в алкан-засвоюючих дріжджів Yarrowia lipolytica. – Рукопис дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2005.

Підтверджено, що пероксисоми Y. lipolytica деградують у вакуолях за механізмом макропексофагії. Вперше виділено та охарактеризовано мутанти Y. lipolytica з пошкодженою деградацією пероксисом та загальною автофагією. Встановлено, що пероксисоми цих мутантів не здатні потрапляти у вакуолі внаслідок пошкодження гена YlTRS85 – функціонального гомолога гена раннього секреторного шляху TRS85 Saccharomyces cerevisiae. Проаналізовано мутант Y. lipolytica із зруйнованим геном UGT51, що кодує гомолог стеролглюкозилтрансферази Ugt51 Pichia pastoris. Показано, що деградація пероксисом Y. lipolytica, на відміну від мікро- та макропексофагії у P. pastoris, не залежить від гена UGT51. Ген YlUGT51 не потрібен також для загальної автофагії та нормального функціонування вакуолей. Зроблено висновок, що макропексофагія та автофагія у Y. lipolytica залежать від раннього секреторного шляху та не залежать від глікозилювання стеролу.

В результаті виконання дисертаційної роботи було встановлено спосіб деградації пероксисом Y. lipolytica та деякі молекулярні механізми пексофагії у цих алкан-засвоюючих дріжджів: деградація пероксисом Y. lipolytica є TRS85-залежним та UGT51-незалежним макропексофагійним процесом, тобто процесом, що залежить від раннього секреторного шляху та не залежить від глікозилювання стеролу.

Головні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Оптимізовано умови для індукції, визначення активності та катаболітної інактивації маркерного пероксисомного ферменту – амінооксидази у колоніях та рідких культурах Y. lipolytica, що дозволило вдосконалити схему відбору мутантів Y. lipolytica з пошкодженою деградацією пероксисом.

2. Розроблено метод одночасного спостереження за пероксисомами та вакуолями Y. lipolytica з одним набором фільтрів для ізотіоціанату флуоресцеїну, що спростило та пришвидшило дослідження пексофагії у дріжджів, а також дозволило підтвердити макропексофагійний механізм транспорту пероксисом до вакуолей в Y. lipolytica.

3. Вперше виділено та охарактеризовано мутанти Y. lipolytica з пошкодженою деградацією пероксисом та загальною автофагією. Встановлено, що пероксисоми у цих мутантів не здатні потрапляти у вакуолі для деградації внаслідок пошкодження гена YlTRS85 – функціонального гомолога гена раннього секреторного шляху TRS85 S. cerevisiae. Введення гена YlTRS85 дикого типу повністю відновлює пексофагію в обох trs85-мутантів Y. lipolytica.

4. Проаналізовано мутант Y. lipolytica із зруйнованим геном UGT51, що кодує гомолог стеролглюкозилтрансферази Ugt51 P. pastoris. Мутант Ylugt51 характеризується підвищеною чутливістю до декану, але не гексадекану, відсутністю стеролглюкозиду та активності стеролглюкозилтрансферази. Введення гена YlUGT51 дикого типу повністю відновлює ріст мутанта на середовищі з деканом, захищаючи клітини від його токсичного впливу.

5. Показано, що деградація пероксисом Y. lipolytica, на відміну від мікро- та макропексофагії у P. pastoris, не залежить від гена UGT51. Ген YlUGT51 також не суттєвий для загальної автофагії та нормального функціонування вакуолей. Це означає, що стеролглюкозилтрансфераза та стеролглюкозид виконують різні функції у метилотрофних та алкан-засвоюючих дріжджів.

Публікації автора:

Статті:

1. Nazarko T.Y., Mala M.J., Sibirny A.A. Development of the plate assay screening procedure for isolation of the mutants deficient in inactivation of peroxisomal enzymes in the yeast Yarrowia lipolytica // Biopolymers and Cell. - 2002. - Vol.18, №2. - P.135-138 (дисертант розробив метод масового відбору мутантів та отримав перші мутанти Y. lipolytica з пошкодженою інактивацією пероксисомних ферментів. Стаття була написана здобувачем та відредагована науковим керівником).

2. Stasyk O.V., Nazarko T.Y., Stasyk O.G., Krasovska O.S., Warnecke D., Nicaud J.M., Cregg J.M., Sibirny A.A. Sterol glucosyltransferases have different functional roles in Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica // Cell Biol. Int. - 2003. - Vol.27, №11. - P.947-952 (дисертант провів молекулярний та фенотиповий аналіз мутанта ugt51 Y. lipolytica та написав відповідні розділи до статті).

3. Nazarko T., Mala M., Nicaud J.M., Sibirny A. Mutants of the yeast Yarrowia lipolytica deficient in the inactivation of peroxisomal enzymes // Visnyk of L’viv Univ. Biology Series. - 2004. - Is.35. - P.128-136 (дисертант підібрав умови, що необхідні для ефективної індукції та інактивації пероксисомних ферментів Y. lipolytica в рідкій культурі, отримав нові мутанти Y. lipolytica з пошкодженою інактивацією амінооксидази та охарактеризував їх біохімічно. Стаття була написана здобувачем та обговорена зі співавторами).

4. Nazarko T.Y., Nicaud J.M., Sibirny A.A. Observation of the Yarrowia lipolytica peroxisome-vacuole dynamics by fluorescence microscopy with a single filter set // Cell Biol. Int. - 2005. - Vol.29, №1. - P.65-70 (дисертант сконструював пероксисомний гібридний білок для флуоресцентного мічення пероксисом Y. lipolytica та розробив метод одночасного спостереження за пероксисомами та вакуолями Y. lipolytica з одним набором фільтрів. Здобувач також отримав експериментальне підтвердження макропексофагійного способу деградації пероксисом Y. lipolytica та написав статтю).

Тези доповідей:

5. Nazarko T.Y., Moroz O.M., Rusyn I.N., Stasyk O.V., Kulachkovsky A.R., Gudz S.P., Sibirny A.A. Regulation of peroxisome homeostasis in methanol- and alkane-utilizing yeasts // Proc. 3^rd INTAS Interdisciplinary Symposium on “General Biochemistry, Biotechnology and Environment”. - Moscow (Russia), 2000. - P.62-63.

6. Nazarko T., Mala M., Nicaud J.-M., Sibirny A. Isolation of the mutants deficient in inactivation of peroxisomal enzymes in the alkane-utilizing yeast Yarrowia lipolytica // Proc. 21^st International Specialized Symposium on Yeasts “Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts”. - Lviv (Ukraine), 2001. - P.143.

7. Nazarko T.Y., Mala M.J. Mutants of the yeast Yarrowia lipolytica deficient in inactivation of peroxisomal amine oxidase // Proc. Conference for Students, PhD Students and Young Scientists on Molecular Biology and Genetics. - Kyiv (Ukraine), 2001. - P.18.

8. Nazarko T., Mala M., Nicaud J.M., Sibirny A.A. Yarrowia lipolytica tagged mutants affected in peroxisomal enzyme inactivation // Third Yarrowia lipolytica International Meeting “Cell Biology and Biotechnology of a Non-conventional Yeast”. - Dresden (Germany), 2002. - P.94.

9. Nazarko T.Y., Nicaud J.M., Sibirny A.A. Peroxisome degradation in the alkane-utilizing yeast Yarrowia lipolytica // Proc. 1^st FEMS Congress of European Microbiologists. - Ljubljana (Slovenia), 2003. - P.343.

10. Nazarko T.Y., Nicaud J.M., Sibirny A.A. Tagging the genes that affect peroxisome degradation in the alkane-utilizing yeast Yarrowia lipolytica // Proc. XXI International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology - Gothenburg (Sweden), 2003. - P.S32.

11. Nazarko T., Nicaud J.M., Sibirny A. Identification of the genes involved in peroxisome autophagy in Yarrowia lipolytica // Proc. 1^st (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology with international representatives. - Lviv (Ukraine), 2004. - P.322.

12. Nazarko T.Y., Nicaud J.M., Sibirny A.A. Yarrowia lipolytica ortholog of secretory pathway gene TRS85 is essential for pexophagy // Proc. FEBS Forum for Young Scientists. - Warsaw (Poland), 2004. - P.26.

13. Nazarko T.Y., Nicaud J.M., Sibirny A.A. Yarrowia lipolytica ortholog of secretory pathway gene TRS85 is essential for pexophagy // Proc. 29^th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies. - Warsaw (Poland), 2004. - P.193.