Анотація до роботи:

Сибірна Н.О. Молекулярні основи змін структурно-функціонального стану клітин крові за умов цукрового діабету 1-го типу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню молекулярних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин крові ( тромбоцитів, еритроцитів, мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитів) і способам корекції метаболічних процесів, які призводять до виникнення та розвитку ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу.

Показано, що в основі біохімічних порушень, які зумовлюють зміни структурно-функціонального стану клітин крові при ЦД 1-го типу, лежить значне зростання продукції оксиду азоту (NO), викликане зміною співвідношення активності ізоформ NO-синтази за рахунок пригнічення активності ендотеліальної конститутивної і посилення експресії та зростання активності індуцибельної NO-синтази (iNOS). Розвиток оксидативного стресу при ЦД 1-го типу викликає активацію вільно-радикальних процесів та акумуляцію значних кількостей активних форм кисню, які ініціюють трансформацію ефектів NO із захисних у цитотоксичні. Посилення фосфорилювання сигнальних білків по тирозину, порушення у процесах транслокації із цитозольної у цитоскелетну фракцію і зміни у експресії та активності c-Src кінази і регуляторної субодиниці р85a фосфатидилінозит-3-кінази, зміна функціонального стану низькомолекулярних G-білків родини Rho, неферментативне глікозилювання та посттрансляційне нітрозилювання білків за участю пероксинітриту є провідними молекулярними механізмами порушення функціонального стану клітин крові, які ведуть до розвитку мікро- та макроангіопатій.

Отримані результати обгрунтовують молекулярні механізми функціонування NO-залежних сигнальних шляхів, процесів фосфорилювання, глюконеогенезу, нітрозування і нітрозилювання та ферментативної антиоксидантної системи, що задіяні у регуляції морфологічного і функціонального стану клітин крові за умов ЦД 1-го типу, та можливості корекції метаболічних порушень при даній патології. Посилення фосфорилювання сигнальних білків по тирозину, неферментативне глікозилювання, посттрансляційне нітрозилювання білків за участю пероксинітриту та активація нейтрофільних гранулоцитів є провідними молекулярними механізмами порушення морфофункціонального стану клітин крові, яке виступає у ролі однієї з основних етіологічних причин розвитку діабетичних мікро- та макроангіопатій.

1. За умов ЦД 1-го типу у клітинах крові відбувається зміна співвідношення активності ендотеліальної та індуцибельної ізоформ NOS. Зниження активності eNOS і посилення експресії та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежать у основі розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації і ведуть до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії.

2. У тромбоцитах людей при ЦД 1-го типу за рахунок активації тирозинових протеїнкіназ посилюється процес фосфорилювання по залишках тирозину ряду специфічних білків, які приймають участь у передачі внутрішньоклітинного сигналу.

3. Стимуляція тромбоцитів тромбіном супроводжується активацією і транслокацією протеїнкінази с-Src із цитозольної у цитоскелетну фракцію. За умов ЦД 1-го типу у тромбоцитах людей включення с-Src кінази у детергент-нерозчинну фракцію відбувається інтенсивніше, а динаміка процесу має чітко виражений фазний характер. Показано, що основна роль у інтеграції протеїнкінази с-Src у цитоскелет належить SH3-домену молекули ферменту, що специфічно зв’язується з білками з молекулярною масою 70 та 125 кДа.

4. Зміни у зв’язуванні специфічних ефекторних білків ( p60, p75, р90, p116, p135, p155, p170) з низькомолекулярними G–білками підродини Rho у тромбоцитах людей, хворих на ЦД 1-го типу, можуть бути покладені в основу молекулярної діагностики генетичних передумов маніфестації і прогресування захворювання.

5. У тромбоцитах за умов ЦД 1-го типу показано зростання експресії та порушення процесу транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної субодиниці р85 ферменту РІ-3-кінази. Це може бути ланкою реципрокної регуляції активностей РІ-3-кінази та NOS.

6. Досліджено ультратонку структуру тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу після впливу L-Arg, L-NAME, L-NMMA, AG та вортманіну in vitro та in vivo. Показано, що AG має найбільший протекторний вплив на структуру тромбоцитів за умов ЦД. Для L- Arg характерна посилююча патологію дія на структуру цих клітин. Вортманін володіє сильно вираженим впливом на стан білків цитоскелету тромбоцитів у нормі, але не виявляє такої дії за умов ЦД 1-го типу.

7. Зміни в системі еритрону при цукровому діабеті виявляються в посиленні еритропоезу (зростає кількість ретикулоцитів периферичної крові і швидкість дозрівання та виходу пізніх попередників еритроцитів та ретикулоцитів з кісткового мозку в русло крові) і з’ясовують механізм розвитку анемії при ЦД 1-го типу на клітинному рівні. Підвищення вмісту фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією організму на розвиток тканинної гіпоксії за даної патології.

8. ЦД 1-го типу супроводжується вираженим перерозподілом вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів нейтрофільних гранулоцитів. На поверхні цих клітин збільшується вміст N-ацетил-,D-глюкозаміно- та N-ацетилнейраміновмісних та зменшується вміст ,D-манозо-, ,D-глюкозо-, N-ацетил-,D-галактозаміно- і ,D-галактозовмісних глікокон'югатів. Комплексне цитохімічне вивчення функціонального стану нейтрофілів з використанням у якості індукторів агрегації лектинів є перспективним напрямком з'ясування патогенезу ЦД 1-го типу та розробки діагностичних і прогностичних підходів у терапії даної патології.

9. При патології виявлено суттєве зростання частоти морфологічних ознак апоптозу та збільшення числа CD95 - позитивних нейтрофільних гранулоцитів та CD95 - позитивних мононуклеарних лейкоцитів людей, що є ознакою ендогенної інтоксикації організму за умов ЦД 1-го типу.

10. Стрес-лімітуюча дія NO має різні форми вияву у нормі та за умов ЦД 1-го типу. Введення селективного інгібітора іNOS – AG, може бути фактором напрямленого модулювання процесу утворення і розпаду депо NO, яке контролюється швидкістю та інтенсивністю нітрозування і нітрозилювання і є перспективним напрямком для подальших досліджень з метою виявлення етіології багатьох патологічних станів та методів їх корекції.

11. Для послаблення токсичної дії NO і корекції патологічного стану, пов’язаного з його гіперпродукцією у організмі за умов ЦД 1-го типу, доцільним є використання аміногуанідину як селективного інгібітора iNOS, інгібітора неферментативного глікозилювання, антиоксиданта, а також чинника, здатного попереджати посттрансляційні модифікації білків за участю пероксинітриту. Інгібітори NOS можуть бути використані у перспективному створенні препаратів, які запобігатимуть розвиткові цукрового діабету або коригуватимуть діабетичні ускладнення.

Публікації автора:

1. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М. Вплив L-аргініну на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Науковий вісник ЛДАВМ ім. С.З.Гжицького, Львів, 2000.- Т.2,№2, (ч.2.) - С. 244-248.

2. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М., Романишин Я.М. Дослідження системи еритрону при гіпоксіях різної етіології // Лабораторна діагностика.- 2000.- № 4.- С.36-39

3. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М Вплив NО на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті. Морфофункціональні зміни кров’яних пластинок // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2000.- Вип. 26.- С.15-20

4. Бурда В.А., Біронт Н.В., ВеликийМ.М., Сибірна Н.О., Клевета Г.Я., Федорович А.М. Характеристика динамічного стану еритрону за умов експериментального стрептозотоцинового діабету // Наукова спадщина академіка І.М.Буланкіна та її розвиток у сучасній біології. Харків, 2001.- С.24-25.

5. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М. Участь різних ізоформ NO-синтази в регуляції метаболізму оксиду азоту при стрептозотоциновому цукровому діабеті // Лабораторна діагностика. - 2001.- №4.- С.22-25.

6. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О. Зміна активності NO-синтази тромбоцитів людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2002.- Вип. 28.- С.47-50.

7. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О. Дослідження функціонального стану цитоскелета тромбоцитів у разі інсулінзалежного цукрового діабету // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2002.- Вип. 28.- С.41-46.

8. Бурда В.А., Біронт Н.В., Сибірна Н.О., Клевета Г.Я. Дослідження функціонального стану еритрону при експериментальному стрептозотоциновому діабеті // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2002.- Вип. 28.- С.21-27.

9. Зарицька М.В., Сибірна Н.О., Великий М.М., Кулачковський О.Р., Плешанів Є.В. Дослідження ультраструктури тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія.- 2002.- №2.- С.83-86.

10. Сибірна Н.О., Барська М.Л. Функціональний стан нейтрофілів при цукровому діабеті 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2003.- № 2.- С. 33-37

11. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Дробот Л.Б. Роль фосфатидилінозит-3-кінази та індуцибельної NO-синтази у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2003.- Вип. 34.- С.52-56.

12. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Грищук І.В. Морфофункціональна характеристика імунокомпетентних клітин крові за умов цукрового діабету 1 типу // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2004.- Вип. 35.- С.77-83.

13. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Лаповець Л.Є. Деякі показники клітинного та гуморального імунітету у хворих цукровим діабетом 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2003.- №4.- С.47-50.

14. Сибірна Н.О. Молекулярні механізми регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів при цукровому діабеті 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2004.- № 1.- С.9-16.

15. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Дробот Л.Б. Зміни функціонального стану низькомолекулярних G-білків тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Український біохімічний журнал. – 2004. - № 2. - С.117-120.

16. Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на морфофункціональний стан тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Досягнення біології та медицини . – 2004. - № 1. - С.67-72.

17. Сибірна Н.О., Бурда В., Люта М. Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Клінічна та експериментальна патологія.- 2004.- Т.3, №2. - С.210-212.

18. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Бродяк І.В. Дослідження рецепторного апарату сегментоядерних нейтрофілів за допомогою лектинів // Клінічна та експериментальна патологія.- 2004.- Т.3, №2. - С.204-206.

19. Сибірна Н., Вовк О., Кулачковський О., Горбачевська І. Вплив вортманіну на ультратонку структуру тромбоцитів у нормі та за умов цукрового діабету 1 типу // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004. - №2. - С. 121-124.

20. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Великий М.М. Роль фосфатидилінозит-3-кінази у регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Український біохімічний журнал. – 2004. - №5. - С.96-101.

21. Makhnevych T., Sybirna N., Veliky M., Drobot L Changes in c-Src-dependent signaling can contribute to the increased platelet aggregation in the IDDM patient // Annales universitatis Mariae Curie-Sklodovska.- 2004.-Vоl. XVI., N2. - P. 43-47.

22. Махневич Т.Р., Сибірна Н.О., Великий М.М., Дробот Л.Б. Дослідження фосфорилювання сигнальних білків, залучених до процесів активації тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004. - № 3. - С. 99-105.

23. Сибірна Н., Вовк О., Бурда В., Федорович А. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2004.- Вип. 38.- С.51-57.

24. Сибірна Н.О., Бродяк І.В., Барська М.Л., Лектиніндукована агрегація нейтрофільних гранулоцитів у хворих на цукровий діабет 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2004.- № 3.- С.57-61

25. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Бурда В.А., Люта М.Я. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи за умов цукрового діабету 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2004.- № 4.- С.47-51.

26. Сибірна Н., Люта М., Бурда В., Біронт Н., Федорович А., Дудок К. Вплив системи „L-аргінін :NO” на динаміку вмісту лігандних форм та спектральні характеристики гемоглобіну за умов цукрового діабету 1-го типу // Медична хімія. - 2004. - Т.6, № 3. - С.26-29.

27. Бурда В.А., Великий М.М., Сибірна Н.О., Федик М.Я., Обросова І.Г. Структурно-функціональний стан еритрону при цукровому діабеті // Матеріали УІ Українського біохім. з’їзду. - Київ, 1992. - C.114.

28. Бурда В.А., Махневич Т.Р., Сибірна Н.О., Біронт Н.В. Перекисне окислення ліпідів і фізико-хімічний стан плазматичних мембран еритроцитів при цукровому діабеті // Матеріали УІІ Українського біохімічного з’їзду. - Київ, 1997. - C.56-57.

29. Біронт Н.В., Бурда В.А., Сибірна Н.О. Система антиоксидантного захисту в еритроцитах та кістковому мозку щурів при стрептозотоциновому діабеті // Матеріали УІІ Українського біохімічного з’їзду. - Київ, 1997. - C.9-10.

30. Бурда В. А., Великий Н.Н., Биронт Н.В., Барская М.Л., Сибирная Н.А. Никотинамид в регуляции антиоксидантной системы организма // Материалы У международной конференции «Биоантиоксидант». - Москва, 18-20 ноября 1998 года. - Москва, 1998. - C.142-143.

31. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М. Корегуючий вплив NO на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Матеріали VIII Кнгресу світової федерації українських лікарських товариств. - Львів- Трускавець, 2000. - С.272.

32. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М. Зміна активності NO-синтази в регуляції функціонального стану тромбоцитів при стрептозотоциновому цукровому діабеті // Матеріали УІ з’їзду ендокринологів України. Київ, 23-25 травня 2001 року. - Ендокринологія.-Т.6(додаток).- 2001. - С.300.

33. Sybirna N., Burda V., Biront N., Kulachkovs’ky A. Studies on the State of Antioxidant System in Rats with Streptozotocin-Induced Diabetes // Abstract, 4-th Parnas Conference, September 15-17, 2002, Wroclaw, Poland.- 2002.- P.91.

34. Сибірна Н.О., Зарицька М.В., Кулачковський О.Р., Барська М.Л. Участь різних ізоформ NO-синтази в регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів за інсулінзалежного цукрового діабету // Матеріали VІІІ Українського біохімічного з’їзду, 1-3 жовтня 2002 року, Чернівці. -Укр. біохім. журнал. - Т.74, № 4а. - Спец. вип. - 2002.- С.78.

35. Кулачковський О.Р., Сибірна Н.О., Зарицька М.В. Вивчення ультраструктури тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Тези доп. ІІІ з’їзду Укр. біофіз. товариства , Львів, Україна, 8-11 жовтня 2002 року. -2002. - С.216.

36. Биронт Н.В., Бурда В.А., Федорович А.Н., Коробов В.Н., Чайка Я.П., Сибирная Н.А. Состояние антиоксидантной системы клеток костного мозга крыс при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Материалы VІ Международной конф. „Биоантиоксидант” 16-19 апреля 2002 года, Москва, Россия. - 2002. - С. 671-672.

37. Сибірна Н., Дробот Л., Кулачковський О., Зарицька М., Вовк О. Дослідження механізмів регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу // Матеріали науково-практичної конференції „Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині”, Київ, 20 березня 2003 року. - Київ.- 2003. - С.85-86.

38. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Грищук І.В., Старикович М.О. Вплив продуктів неферментативного глікозилювання білків на деякі показники функціональної активності сегментоядерних нейтрофілів за умов інсулінзалежного цукрового діабету у разі гіперглікемії in vitro // Матеріали науково-практичної конференції „Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині”, Київ, 20 березня 2003 року. - Київ. - 2003. - С. 86-87.

39. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Зарицька М.В., Федорович А.М., Кулачковський О.Р. Функціональна активність тромбоцитів при цукровому діабеті 1 типу // Тези доповідей міжнародної наукової конференції „Гомеостаз: фізіологія, патофізіологія, фармакологія і клініка”, Одеса, 18-19 вересня 2003 року. - Одеса. - 2003. - С. 31-32.

40. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Кулачковський О.Р., Вовк О.І., Зарицька М.В. Вплив аміногуанідину на структурно-функціональні властивості тромбоцитів при стрептозотоциновому діабеті у щурів // Тези доповідей Науково-практичної конференції „Діабет-проблема загальнолюдська” у рамках Х Міжнародних Днів Діабету, Дніпропетровськ, 24-25жовтня 2003 р. - Дніпропетровськ. - С.116-117.

41. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Вовк О.І., Біронт Н.В., Федорович А.М. Вплив аміногуанідину на систему антиоксидантного захисту та активність індуцибельної NO-синтази при цукровому діабеті 1 типу // Тези доповідей Науково-практичної конференції „Діабет-проблема загальнолюдська” у рамках Х Міжнародних Днів Діабету, Дніпропетровськ, 24-25жовтня 2003 р. - Дніпропетровськ. - С.117-118.

42. Sybirna N., Vovk O., Kulachkovsky O. Role of phosphoinositide 3-kinase in platelet aggregation under the type 1 diabetes mellitus // Abstracts of the 29^th Meeting of the FEBS, Warsaw, Poland, 26 June – 1 July 2004. - The FEBS Journal. – 2004. - Vol. 271, №1. - P.130.

43. Sybirna N., Barska M., Dzewulska-Szwajkowska D., Dzugaj A. Mononucleares and polymorphonucleares show increased fructose-1,6- bisphosphatase activity in patients with type 1 diabetes mellitus // Матеріали Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології, Львів, 25-28 квітня 2004р. – Львів. – 2004. - C.295.

44. Вовк О., Бурда В., Федорович А., Зарицька М., Сибірна Н. Вплив інгібіторів NO-синтази на антиоксидантний статус щурів за умов стрептозотоцинового діабету // Матеріали Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології , Львів, 25-28 квітня 2004р. – Львів. – 2004. - C.214.

45. Федорович А., Сибірна Н., Бурда В. Вплив аміногуанідину на процеси інгібування автоокислення адреналіну супероксиддисмутазою гемолізатів еритроцитів крові щурів із експериментальним цукровим діабетом // Матеріали VII міжнародної науково-практичної конференції „Наука і освіта ‘2004 ”, 10-25 лютого 2004 р. - Т.56.- Біологічні науки. - С. 8-9.

46. Зарицька М., Сибірна Н., Дробот Л. Роль вортманіну – селективного інгібітора фосфоінозитид-3-кінази - в активації тромбоцитів при інсулінозалежному цукровому діабеті // Матеріали міжнародної науково-практичної конференції „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини”, 11-12 листопада 2004 р., Тернопіль. - Медична хімія. - Т.6, № 3. - 2004. - С.181.