Анотація до роботи:

Капустяк К.Є. Мутація rib1-86 як інструмент для виявлення генів, задіяних у регуляції біосинтезу рибофлавіну та гомеостазу заліза у дріжджів Pichia guilliermondii – Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена дослідженню генетичних механізмів супресії мутації rib1-86, яка пошкоджує ген RIB1 (кодує фермент ГТФ-циклогідролазу II, яка каталізує перший етап флавіногенезу) і спричиняє повну ауксотрофність по РФ у мутантів P. guilliermondii. Мутанти rib1-86 здатні спонтанно ревертувати до прототрофності по РФ з частотою до 10^-6. Клонування і наступне секвенування мутантного алеля rib1-86 показало наявність точкової мутації у положенні + 620 п.н. вправо від старт-кодону. Заміна гуаніну на аденін в цій точці перетворює цистеїновий кодон на тирозиновий (C207Y). Генетичний аналіз колекції спонтанних ревертантів мутанта rib1-86 дозволив виявити 6 нових генів RED1-RED6 (reduction), що беруть участь у регуляції біосинтезу РФ та метаболізму заліза. У порівнянні із штамом дикого типу мутанти red характеризуються наступними властивостями: підвищеною активністю ГТФ-циклогидролази і РФ-синтази, а також збільшеним рівнем біосинтезу РФ; збільшеною Fe/Cu-редуктазной активністю і підвищеним вмістом негемінового заліза в клітках; високою чутливістю до перехідних металів. Вперше показано, що у P. guilliermondii надсинтез РФ, викликаний дефіцитом іонів заліза або пошкодженням регуляторних генів, корелює із зростанням рівнів мРНК ключових ферментів цього біосинтетичного шляху.

В результаті виконання дисертаційної роботи було встановлено природу та локалізовано мутацію rib1-86 у дріжджів P. guilliermondii. Це дало змогу розробити новий метод позитивної селекції мутантів з порушеною регуляцією флавіногенезу і метаболізму металів, та виявити 6 нових генів, що впливають на дані процеси. Вперше показано, що у P. guilliermondii залізо-залежна регуляція біосинтезу РФ дійсно відбувається на транскрипційному рівні. Головні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Клоновано та секвеновано мутантну алель rib1-86. У положенні + 620 п.н. вправо від старт-кодону виявлено точкову мутацію. Заміна гуаніну на аденін в цій точці перетворює цистеїновий кодон на тирозиновий (C207Y) і пошкоджує структуру одного із найбільш консервативних кластерів характерних для ГТФ-циклогідролаз II багатьох організмів.

2. Виявлено, що мутація rib1-86 (C207Y) викликає «leaky» ауксотрофність за РФ та веде до підвищення частоти появи спонтанних мутацій у дріжджів P. guilliermondii.

3. На основі дослідження механізмів супресії мутації rib1-86 розроблено новий метод позитивної селекції мутантів з порушеною регуляцією флавіногенезу та метаболізму металів.

4. Серед спонтанних ревертантів Rib⁺ виявлено порівнянно велику кількість локусів, здатних супресувати rib1-86, серед них як описані раніше (rib80, rib81, hit1), так і шість нових комплементаційних класів red1 – red6.

5. Показано, що всі red-мутації є рецесивними і моногенними. У порівнянні із штамами дикого типу red-мутанти мають низку фенотипових відмінностей:

всі red-мутанти мають підвищену активність ферментів флавіногенезу (ГТФ-циклогідролази в 3,5-4,5 рази , РФ-синтази в 1,4-2,5 рази) і, як наслідок, посилений синтез РФ (у 3-10 разів); у них посилена (в 4-7 разів) фериредуктазна активність і збільшений (в 3-5 разів) вміст негемінового заліза в клітині; red-мутації збільшують чутливість клітин дріжджів до іонів міді, кобальту, цинку, кадмію і срібла. Крім того, мутації red4, red5 і red6 викликають у дріжджів гіперчутливість до іонів заліза і оксидативного стресу, викликаного пероксидом водню.

6. Виявлено, що ген RIB81 синергідно взаємодіє з генами RED1 та RED6 у процесі регуляції біосинтезу РФ. Нововиявлені гени RED1-RED6, очевидно, є компонентами регуляторного механізму, який координує процеси біосинтезу РФ, метаболізму металів, а також реакції на стрес у дріжджів P. guilliermondii.

7. Показано, що що у P. guilliermondii надсинтез РФ, викликаний дефіцитом іонів заліза або пошкодженням регуляторних генів, корелює із зростанням рівнів мРНК ключових ферментів цього біосинтетичного шляху, що свідчить про транскрипційний рівень залізо-залежної регуляції біосинтезу РФ у P. guilliermondii,

Публікації автора:

1. М.М. Стенчук Новий ген RED1, який контролює біосинтез рибофлавіну і активність фериредуктази у дріжджів Pichia guilliermondii / М.М. Стенчук, К.Є. Капустяк // Біополімери і клітина. - 1999. -Т.15, №6. -С.522-528.

(Дисертант особисто проводив селекцію та аналіз мутантів red1, брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, оформленні та написанні статті).

2. К.Є. Капустяк Спільний вплив мутацій red2 і red3 на біосинтез рибофлавіну та фериредуктазну активність у дріжджів Pichia guilliermondii / К.Є. Капустяк, М.М. Стенчук // Вісник Львівського університету. -2001.-Вип.27.-С.194-203.

(Дисертант оержував подвійні мутанти red2red3 та проводив іх аналіз, брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, оформленні та написанні статті).

3. Н.Н. Стенчук Мутации red нарушают регуляцию флавиногенеза и гомеостаз металлов у дрожжей Pichia guilliermondii / Н.Н. Стенчук, К.Е. Капустяк // Генетика. -2003. -Т.39, №8. -С.1026-1032.

(Дисертант особисто проводив селекцію та аналіз мутантів red1 – red6 , брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, оформленні та написанні статті).

4. Y.R. Boretsky Positive selection of mutants defective in transcriptional repression of riboflavin synthesis by iron in the flavinogenic yeast Pichia guilliermondii / Y.R. Boretsky, K.Y. Kapustyak, L.R. Fayura, O.V. Stasyk, M.M. Stenchuk, Y.P. Bobak, L.B. Drobot, A.A. Sibirny //FEMS YeastResearch. -2005. №5. -Р. 829-837.

(Дисертант особисто проводив ампліфікацію та клонування мутантної алелі rib1-86, перевірку мутабільності штамів, біохімічний аналіз мутантів red1 – red6, та брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

5. K.Y. Kapustiak Mutations derepressing riboflavin biosynthesis suppress GTP cyclohydrolase deficiency and lead to defects in regulation of iron acquisition in the flavinogenic yeast Pichia guilliermondii : Abstracts of XXIthYGM Conference / K.Y. Kapustiak, M.M. Stenchuk, Y.R. Boretsky, O.V. Stasyk, V.I. Kutsiaba, A.A. Sibirny - Gеteborg (Sweden July), 2003. –P. 12-21.

6. Y.R. Boretsky Interrelationship between riboflavin biosynthesis and iron transport in the yeast Pichia guilliermondii : Abstracts of „Bioiron 2003” Conference / Y.R. Boretsky, K.E. Kapustiak, M.M. Stenchuk, O.V. Stasyk, V.I. Kutsyaba, A.A. Sybirny– Bethesda ( USA), 2003. –P.312.

7. K. Kapustyak Decrease in GTP cyclohydrolase II activity leads to increased mutation frequency in the yeast Pichia guilliermondii: Abstracts of 1^st UCCB 2004 Inaugural Ukrainian Congress on Cell Biology / K. Kapustyak, Y. Boretsky, L. Fayura, O. Stasyk, M. Stenchuk, A. Sibirny. – Lviv, 2004. –P.379.

8. K.E. Kapustiak Mutation rib1-86 as a tool for identification of new genes involved in control of riboflavin biosynthesis in yeast Pichia guilliermondii: Abstracts of 1^st FEMS Congress of European Microbiologists / K.E. Kapustiak, M.M. Stenchuk, Y.R. Boretsky, O.V. Stasyk, A.A. Sybirny. Ljubljana (Slovenia), 2003. –P.349-350.

9. Y. Boretsky Ion regulates riboflavin biosynthesis in the yeast Pihiaguilliermondii at transcriptional level: Abstracts of 5th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cellular signaling” / Y. Boretsky, K. Kapustyak, D. Fedorovych, L. Fayura, Y. Bobak, L. Drobot, A. Sibirny. -Kyiv,2005. –P.162.