Анотація до роботи:

Вітко Ю.М. Об'ємрегульовані хлорні канали в клітинах карциноми простати: вплив кальційхелатуючих речовин, рН і протеаз. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика.- Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.- Київ.- 2002.

Дисертація присвячена дослідженню основних характеристик об'ємактивованого хлорного струму I_Cl,swell у епітеліальних клітинах простати LNCaP та вивченню їх модуляції зовнішньоклітинним Са²⁺, хелаторами Са²⁺, протонами та трипсином. Проведені дослідження підтвердили участь I_Cl,swell у відновленні об'єму клітини за умов гіпотонічного стресу. Описана пряма блокуюча дія кальційхелатуючих речовин на об`ємрегульований аніонний канал (ОРАК), яка, імовірно, є загальною рисою всіх ОРАК. Виявлено вплив зовнішньоклітинного рН на амплітудні та кінетичні (інактивація) характеристики струму, а також на його чутливість до змін клітинного об'єму. Висунуто припущення, що ОРАК у клітинах LNCaР мають у своїй структурі як мінімум дві рН-чутливі молекулярні групи з рК~6, титрування яких модулює амплітуду струму, і дві протон-чутливі групи, що беруть участь у потенціалзалежнійованій інактивації С-типу каналу. Показано, що внутрішньоклітинно введений протеолітичний фермент трипсин спричинює значне збільшення чутливості каналів до змін клітинного об'єму, збільшення амплітуди I_Cl,swell і практично повне усунення інактивації N-типу. Висунуто припущення про наявність у ОРАК відповідальної за об'ємзалежність та інактивацію внутрішньклітинної детермінанти, що підлягає протеолітичному відщепленню та може функціонувати згідно з "ball-and-chain" механізмом.

1. На клітинній лінії карциноми простати людини за допомогою методу "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина" досліджені основні характеристики (показники розвитку, зменшення та потенціалзалежної інактивації) трансмембранного хлорного струму I_Cl,swell, що активується у відповідь на осмотично зумовлене збільшення об'єму клітини, а також їхня модуляція зовнішньоклітинним кальцієм, кальційхелатуючими речовинами, протонами та внутрішньоклітинно прикладеним трипсином. Показано, що активація I_Cl,swell є одним із основних механізмів, за допомогою якого клітина відновлює свій об'єм за умов гіпотонічного стресу.

2. Встановлено, що зовнішньоклітинний кальцій сам по собі не впливає на характеристики I_Cl,swell, однак кальційхелатуючі речовини - BAPTA, EDTA і HEDTA - призводять до швидкого, зворотнього, потенціалзалежного блокування струму завдяки прямій взаємодії з об'ємрегульованими аніонними каналами, що переносять I_Cl,swell.

3. Показано, що величина негативного заряду вільної форми кальцієвого хелатору є визначальною для блокування ОРАК. Максимальне блокування досягалося за допомогою ВАРТА (67%, IC₅₀=70 мкмоль/л при +100 мВ). Чутливість до кальційхелатуючих речовин, імовірно, є загальною властивістю всіх ОРАК незалежно від типу клітин, у яких вони експресовані. Зроблено акцент на ретельному доборі типу та концентрації кальцієвих хелаторів для задоволення експериментальних потреб. Отримані результати дозволили встановити верхню межу діаметра пори ОРАК ~0,8 нм, що відповідають розрахунковому діаметру молекули EDTA.

4. Показано комплексність дії зовнішньоклітинного рН на I_Cl,swell у клітинах карциноми простати. Встановленно, що рН впливає на амплітудні та кінетичні (інактивація) характеристики струму, а також на його чутливість до змін клітинного об'єму. Висунуто припущення, що ОРАК у клітинах LNCaР мають у своїй структурі як мінімум дві рН-чутливі молекулярні групи з близькими рК~6, титрування яких модулює амплітуду струму, і дві додаткові протончутливі групи, що беруть участь у потенціалзалежній інактивації каналу.

5. Показано, що введення всередину клітини LNCaР протеолітичного ферменту трипсину істотно модифікує роботу ОРАК, спричинюючи значне збільшення чутливості каналів до змін клітинного об'єму, збільшення амплітуди I_Cl,swell і практично повне усунення потенціалзалежної інактивації. Висунуто припущення про наявність з цитоплазматичного боку ОРАК структурної детермінанти, яка зазнає протеолітичного відщеплення, що визначає його об'ємзалежність та інактивацію. Зроблено припущення, що ця детермінанта функціонує згідно з "ball-and-chain" механізмом, характерним для натрієвих і калієвих каналів.

6. Встановлено, що модифікація потенціалзалежної інактивації I_Cl,swell зовнішньоклітинними протонами та внутрішньоклітинно прикладеним трипсином відбувається незалежно, в результаті їхнього впливу на різні структурні детермінанти ОРАК. Висунуто припущення про наявність двох типів інактивації в ОРАК, і що трипсин впливає на інактивацію N-типу, а протони - на інактивацію С-типу.

7. Отримані результати дозволяють зробити обґрунтовані висновки про наявність структурних детермінант, що визначають рН-залежність, проникність, об'ємчутливість і інактивацію ОРАК. Ці дані є корисними для розуміння структурної організації ОРАК і можуть бути використані для розробки фармакологічних агентів, здатних впливати на його функцію.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації.

Статті:

1. Vitko Y.M., Pogorelaya N.H., Prevarskaya N., Skryma R., Shuba Y.M. Proteolytic modification of swelling-activated Cl^- current in LNCaP prostate cancer epithelial cells // J. Bioerg. and Biomembr.- 2002. - Vol.34, №4, P. 307-315.

2. Lemonnier L., Vitko Y., Shuba Y.M., Vanden Abeele F., Prevarskaya N., Skryma R. Direct modulation of volume-regulated anion channels by Ca²⁺ chelating agents // FEBS Lett.- 2002.- №521.- P. 152-156.

3. Вітко Ю.М., Лазаренко Р.М., Погорєла Н.Х. Вплив внутрішньоклітинного введення трипсину на характеристики потенціалзалежної інактивації хлорного струму в клітинах раку простати // Фізіол. журн. - 2002.- Т. 48, №3.- C. 41-49.

4. Вітко Ю.М., Погорєла Н.Х., Преварська Н., Скрима Р., Шуба Я.М. Вплив зовнішньоклітинного рН на об'ємактивований хлорний струм в епітеліальних клітинах карциноми простати // Фізіол. журн.- 2002.- Т. 48, №4.- C. 19-27.

Тези доповідей:

1. Вітко Ю.М., Лазаренко Р.М., Погорєла Н.Х., Преварська Н., Скрима Р., Шуба Я.М. Залежність об'ємактивованого аніонного струму в епітеліальних клітинах карциноми простати від зовнішньоклітинного рН // Тези доповідей ХVI з`їзду Українського фізіологічного товариства.- Фізіол. журн.- 2002.- Т.48, №2.- C. 4.

2. Vitko Y.M., Pogorela N.H., Shuba Y.M. Trypsin-mediated modulation of I_Cl,swell in the LNCaP human prostate cancer cell line // Programme and abstracts of “International Symposium Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems”.- Kyiv.- 2001.- P. 109.

3. Shuba Y., Lemonnier L., Vitko Y., Prevarskaya N., Skryma R. Volume-regulated anion conductance in the prostate cancer epithelial cells // Program and Abstracts UMFG SAV of "The first Multilateral Conference of the Physiologists from Central Europe.- Bratislava.- -2002.- P. 67.

4. Вітко Ю.М., Лазаренко Р.М., Погорєла Н.Х. Вплив внутрішньоклітинного трипсину на характеристики потенціалзалежної інактивації хлорного струму в клітинах простати // Тези доповідей III з`їзду Українського біофізичного товариства. -Київ.- 2002.- С. 69.

5. Vitko Y.M., Pogorelaya N. C., Shuba Y. M. Trypsin-mediated modification of volume-regulated anion channels in LNCaP prostate cancer cells // 46^th Annual Meeting Abstracts.- Biophys. J.- 2001.- P. 244-245.

Анотації: