72. Мелешко Руслан Анатолійович. Одержання біологічно-активного пролактину людини із використанням бакуловірусної експресійної системи: дис... канд. біол. наук: 03.00.20 / НАН України; Інститут молекулярної біології та генетики. - К., 2005.
Анотація до роботи:
Мелешко Р.А. Одержання біологічно-активного пролактину людини з використанням бакуловірусної експресійної системи.– Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.
Дисертація присвячена вивченню експресії рекомбінантного пролактину людини з використанням бакуловірусної експресійної системи (БЕС) та розробці лабораторної методики одержання і очищення біологічно-активного рекомбінантного пролактину людини.
Вперше було синтезовано рекомбінантний PRL людини в бакуловірусній експресійній системі на основі ВЯП Malacosoma neustria (Mane). Сконструйовано рекомбінантні бакуловіруси, що забезпечують експресію внутрішньоклітинного та секретованого рекомбінантного пролактину людини в клітинах комах.
Відпрацьовано умови культивування клітин, інфікування їх вірусом, визначено оптимальний час після інфікування для збору клітин і середовища з метою досягнення максимальних рівнів експресії пролактину, розроблено методи очищення біологічно-активного рекомбінантного пролактину людини, що дозволяє отримати дві форми рекомбінантного гормону – внутрішньоклітинну і секретовану у кількостях 60 мг і 10 мг білка відповідно на один літр поживного середовища.
На базі проведених досліджень запропоновано лабораторну методику одержання біологічно-активного рекомбінантного очищенного пролактину людини.
В дисертаційній роботі досліджено експресію рекомбінантного пролактину людини в бакуловірусній експресійній системі. Розроблено методи очистки біологічно-активного білка.
Сконструйовано рекомбінантні бакуловіруси ManePRL, AcPRL, AcHisPRL, AcMelPRL та AcMelPRLHis, що несуть ген пролактину під промотором гена поліедрину.
Одержано ефективну експресію рекомбінантного пролактину людини в культурі клітин Ар (50-70 мг на 1 л поживного середовища), Sf (85 -120 мг/л) та HF (175 -245 мг/л).
Підібрано оптимальні умови для експресії рекомбінантного пролактину людини – культивування в суспензійній культурі та умови інфікування клітин, що забезпечило високий рівень експресії rPRL – близько 500 мг/л внутрішньоклітинного і близько 30 мг/л секретованого.
Розроблено методи очищення внутрішньоклітинного rPRL (метал-афінна хроматографія) та секретованого (гепарин-афінна хроматографія), які дозволили одержати високий рівень очистки рекомбінантного білка (95%).
Застосування розроблених методів дозволило отримати до 60 мг/л очищеного внутрішньоклітинного rPRL, та до 10 мг/л секретованого rPRL на 1 л поживного середовища.
На основі одержаних результатів розроблено лабораторну методику одержання біологічно-активного внутрішньоклітинного і секретованого рекомбінантного пролактину із застосуванням БЕС.
Публікації автора:
Строковская Л.И., Мелешко Р.А., Кихно И.М., Соломко А.П. Сравнительное исследование эффективности экспрессии рекомбинантного пролактина человека в двух бакуловирусных системах // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, №5. – С. 423-428.
Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід і рекомбінантних бакуловірусів, інфікування культур клітин, аналіз білків у ПААГ.
Kihno I.M., Strokovskaya L.I., Meleshko R.A., Michalic J., Solomko A.P Physical mapping of Malacosoma neustria nuclear polihedrosis virus genome and its modification in Аnthenaraea pernyi cell culture // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, №6. – С. 522-528.
Особистий внесок здобувача – рестрикційний аналіз ДНК, складання фізичної карти.
Строковская Л.И., Мелешко Р.А., Кихно И.М., Соломко А.П. Очистка внутриклеточного рекомбинантного пролактина человека, синтезированного в клетках насекомых с помощью бакуловирусного вектора // Біополімери і клітина. – 2004. – Т. 20, №3. – С. 1-6.
Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід і рекомбінантних бакуловірусів, відпрацювання очистки білка Методом 1 та Методом 2, аналіз білків у ПААГ.
Строковская Л.И., Кихно И.М., Мелешко Р.А., Соломко А.П. Экспрессия секретируемого рекомбинантного пролактина человека в клетках насекомых // Біополімери і клітина. – 2004. – Т. 20, №4. – С. 325-330.
Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід і рекомбінантних бакуловірусів, аналіз білків у ПААГ.
