Анотація до роботи:

Павлішко Г.М. Оксидази метилотрофних дріжджів і цвільових грибів: характеристика та біоаналітичне використання. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступення кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2005.

Дисертаційна робота присвячена виділенню, фізико-хімічній, ензимологічній характеристиці і біоаналітичному використанню алкогольоксидази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, скринінгу продуцентів гліцеролоксидази серед деяких цвільових грибів, її виділенню і початковій структурній та ензимологічній характеристиці.

Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату алкогольоксидази з мутантних клітин метилотрофних дріжджів H. polymorpha, вирощених на глюкозі. Досліджено деякі фізико-хімічні та ензимологічні характеристики ферменту.

Розроблено новий оксидазно-хімічний метод визначення етанолу. За використання алкогольоксидази та 3-метил-2-бензотіазолінонгідразину розроблено новий метод роздільного визначення метанолу та формальдегіду в їх сумішах.

На основі високоочищеного препарату алкогольоксидази H. polymorpha і пероксидази хрону з використанням осмійвмісного полімерного медіатора розроблено лабораторний прототип амперометричного біосенсора, вивчено його аналітичні характеристики та показана придатність для визначення алкоголю у винах.

У результаті комплексу експериментальних робіт проведено скринінг продуцентів гліцеролоксидази, виділено та охарактеризовано оксидази біоаналітичного значення: алкогольоксидазу з мутантного штаму метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha і гліцеролоксидазу із цвільового гриба Botrytis allii; створено нові ензиматичні та біосенсорні аналітичні підходи для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах з використанням алкогольоксидази.

Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Розроблено оптимальну схему виділення високоочищеного препарату алкогольоксидази (з питомою активністю понад 23 мкмольхв^-1мг^-1) з клітин надпродуцента ферменту – мутанта термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX).

2. Проведено фізико-хімічну, структурну та ензимологічну характеристику виділеної алкогольоксидази: визначено ізоелектричну точку (рІ=6,2); отримано спектри поглинання та спектри кругового дихроїзму; розраховано вміст окремих структурних мотивів вторинної структури білка; визначено кінетичні параметри ферменту відносно основних субстратів.

3. Розроблено протоколи алкогольоксидазно-пероксидазного методу аналізу, адаптовані для визначення вмісту аналітів у реальних зразках: етанолу (для алкогольних напоїв, виноматеріалів та бродильних культур) і формальдегіду (для харчових продуктів).

4. Розроблено новий ензиматично-хімічний метод одночасного визначення метанолу та формальдегіду в їх сумішах за використання алкогольоксидази та 3-метил-2-бензотіазолінонгідразину і показано придатність цього підходу для аналізу реальних зразків (стічних вод, формаліну).

5. На основі алкогольоксидази метилотрофних дріжджів та пероксидази сконструйовано біензимний амперометричний біосенсор для кількісного визначення етанолу, який, завдяки використанню оригінальної схеми електроосадження ферментів і опосередкування електронного переносу через осмій-вмісний редокс-полімер, має високу операційну стабільність (понад 1000 аналізів) та високу чутливість (до 0,2 мкА/мМ).

6. Проведено скринінг штамів цвільових грибів за здатністю до синтезу гліцеролоксидази, відібрано кращий продуцент ферменту – Botrytis allii 100(5). Виділено гліцеролоксидазу із клітин B. allii та проведено початкову структурну та ензимологічну характеристику ферменту.

Публікації автора:

1. Gonchar M.V., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Sibirny A.A. A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages // Food Technol. Biotechnol. - 2001. - Vol. 39, № 1. - P. 37 - 42. (Дисертант брала участь у препаративному отриманні ферменту, провела його електрофоретичний аналіз).

2. Павлішко Г. М., Майдан М. М., Гончар М. В., Сибірний А. А. Новий оксидазний метод визначення лактату // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 2. - С. 134 - 139. (Дисертант провела експерименти по розробці оксидазно-хімічного методу визначення аналіту із заміною пероксидазної реакції на хімічну з використанням МБТГ, який був використаний і для аналізу інших аналітів).

3. Gonchar M., Maidan M., Pavlishkо H., Sibirny A. Assay of ethanol in human serum and blood by the use of a new oxidase-peroxidase based kit // Bісник Львівського університету. - Серія біологічна. - 2002. - Вип. 31. - С. 22 - 27. (Дисертант отримала препарат алкогольоксидази та брала участь у визначенні оптимального складу діагностичного набору).

4. Павлішко Г.М., Гончар Т.М., Гончар М.В. Хімічний та ензиматичний аналіз вмісту формальдегіду у рибних продуктах // Експ. клін. фізіол. біохім. - 2003. - № 4. - С. 56 - 63. (Дисертант отримала препарат алкогольоксидази та провела порівняння аналітичних параметрів різних методів визначення формальдегіду).

5. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар M. Алкогольоксидаза та її біоаналітичне використання // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 3 - 22. (Дисертант особисто опрацювала дані літератури та взяла участь у написанні огляду).

6. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар M. Скринінг штамів продуцентів, очищення та первинна

характеристика гліцеролоксидази із цвільових грибів // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 38. - С. 67 - 73. (Дисертант здійснила скринінг цвільових грибів, провела очистку гліцеролоксидази та вивчила вплив різних речовин на стабільність ферменту).

7. Gonchar M.V., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Sibirny A.A. Bioanalytical applications of metabolically engineered strains of methylotrophic yeasts // Abs. Bio-Forum II. “Polish Biobusiness as a Parther of international Enterprises” (May 10-11, 2001, Lodz, Poland). - P. 99-101.

8. Sibirny V.A., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Stasyk O.G., Smutok O.V, Stel’mashchuk S., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Bioanalytical application of ezymes from methylotrophic yeasts // Abs. of 21^st International Specialized Symposium on Yeasts (August 21-25, 2001, Lviv, Ukraine). - P. 84.

9. Gayda G.Z., Smutok O.V., Pavlishko H.M., Gonchar M.V. Regulation of synthesis, isolation and bioanalytical application of L-lactate cytochrome c oxidoreductase (flavocytochrome b₂) from thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // Abs. 4^th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (September 15-17, 2002, Wroclaw, Poland). - P. 84.

10. Павлішко Г.М., Смуток О.В., Гайда Г.З., Гончар М.В. Нові оксидазні методи аналізу етанолу, метанолу, формальдегіду та лактату // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції "БІОХІМІЯ” (21-25 квітня 2003 р., Дніпропетровськ). - 2003. - С. 37-39.

11. Gonchar M., Pavlishko H., Oklejewicz B., Grabek D., Kotylak Z., Sibirny A., Sibirny W. Nowa enzymatyczna metoda rownoczesnego oznaczania zawartosci formaldehydu i metanolu w sciekach przemyslowych // II Krajowy Kongres Biotechnologii. Materialy konferencyjne (23 - 27 czerwca 2003 r., Lodz, Polska). - 2003. - Р. 86.

12. Gayda G., Pavlishko H., Smutok O., Demkiv O., Pavlyk A., Gonchar M., Sakharov I., Csregy E., Schuhmann W. Selection of microbial producers, isolation, purification and application of some enzymes of bioanalytical importance // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (25 - 28 April, 2004, Lviv, Ukraine). - 2004. - P. 101.

13. Gonchar M., Gayda G., Pavlishko H., Smutok O., Sibirny V., Kotylak Z., Sibirny A. Metabolically engineered yeast cells and enzymes as the biorecognition elements of biosensors // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (April 25 - 28, 2004, Lviv, Ukraine). - 2004. - P. 85.

14. Гончар М.В, Гайда Г.З., Павлішко Г.М., Смуток О.В., Демків О.М., Шлеєв С.В., Ярополов А.І., Чорегі Е., Шуман В. Виділення, очистка, характеристика та біоаналітичне використання оксидоредуктаз мікробного походження // Тези доповідей Х з’їзду товариства мікробіологів України (15 - 17 вересня, 2004, Одеса, Україна).- 2004. - С. 21.

15. Смуток О.В., Павлішко Г.М., Демків О.М., Закальська О.М., Гайда Г.З., Гончар М.В.

Нові ензиматичні та біосенсорні методи контролю вмісту етанолу, лактату та гліцерину в алкогольних напоях // Тези доповідей ІІ Всеукраїнської науково-практичної конференції „Біотехнологія. Освіта. Наука” (6 - 8 жовтня 2004 р., Львів, Україна). - 2004. - С. 125.

16. Гончар М.В., Гайда Г.З., Павлишко Г.М., Смуток О.В., Демкив О.М., Чореги Е., Шуман В. Микробные оксидо-редуктазы: генетическое конструирование продуцентов, выделение, очистка и биоаналитическое применение ферментов // Тезисы Всеросийского симпозиума „Биотехнология микробов”. (21 - 24 октября 2004 г., Москва, Россия). - 2004. - С. 21.