Дробот Людмила Борисівна. Особливості організації і функціонування сигнальних мереж в нормальних та пухлинних клітинах : дис... д-ра біол. наук: 03.00.11 / НАН України; Інститут біології клітини. - Л., 2005.
Анотація до роботи:
Дробот Л.Б. Особливості організації і функціонування сигнальних мереж в нормальних та пухлинних клітинах. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2005.
Дисертація присвячена дослідженню особливостей динаміки сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах на моделях зародків тварин, що розвиваються, та трансформованих клітин у культурі, експериментальному обґрунтуванню гіпотези стосовно критичної ролі адаптерних/риштувальних білків в організації і координації сигнальних мереж, їхньої стехіометрії в надмолекулярних сигнальних комплексах у забезпеченні специфічності та інтенсивності внутрішньоклітинного сигналювання.
Показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі костистої риби в’юна (Misgurnus fossilis L.) є їх системний коливний характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних поліпептидних факторів росту (інсуліну і EGF) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних зародках (від пригнічення їхньої активності при високому рівні в контролі і, навпаки, до стимуляції – при низькому рівні в контролі).
Існування взаємоузгоджених осциляцій сигнальних процесів підтверджено на моделі клітин еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії онкогенної тирозинової кінази р210Bcr-Abl. Встановлена кореляція між динамічними системними змінами стехіометрії адаптерних білків Grb2, Shc, с-Cbl і р85, регуляторної субодиниці РІ-3-кінази, в Bcr-Abl-опосередкованих надмолекулярних комплексах і рівнем Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигналювання в процесі еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації клітин К562, індукованої гербіміцином А і форбол-міристат-ацетатом, відповідно.
Показано, що регуляторна р85 субодиниця РІ-3-кінази та ендонуклеаза(и) є зв’язувальними партнерами нового адаптерного білка Ruk, ідентифіковані домени і мотиви сигнальних білків, залучені до міжмолекулярної взаємодії, виявлені осциляції у здатності пролін-багатих мотивів Ruk взаємодіяти з екзогенними лігандами. Встановлено, що здатність адаптерного білка інгібувати активність ліпідкінази залежить від його стехіометрії в надмолекулярному комплексі. Виявлено зниження рівня експресії повнорозмірної форми Ruk у світлоклітинних карциномах нирки людини.
Проведено комплекс експериментальних робіт, за результатами яких запропоновано гіпотезу про системний характер осциляцій сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах евкаріот та їхню роль в координації спряжених сигнальних шляхів. Запропоновано і експериментально доведено концепцію стосовно критичної ролі стехіометрії адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах в забезпеченні специфічності і інтенсивності сигналювання. Отримані дані обгрунтовують можливості впливу на специфічні ланки сигнальних мереж за тих чи інших патологічних станів.
1. На моделі зародків костистої риби в’юна (Misgurnus fossilis L.) ідентифіковано і охарактеризовано ряд сигнальних ланок, що активуються на початкових етапах ембріонального розвитку тварин:
- вперше виявлені і охарактеризовані функціональні рецептори інсуліну і EGF в клітинах зародків в’юна на стадії ранньої гаструли;
- охарактеризовано кінетичні параметри високоафінної GTPазної активності G-білків плазматичних мембран зародкових клітин, ізольованих на стадії ранньої гаструли, ідентифіковано субстрати кашлючного (Ga0 з Mr 29 кДа) та ботулінічного (з Mr 26 і 28 кДа) токсинів, SMG-білки підродин Rho/Rac та Ras;
- ідентифіковано фосфотирозинвмісні білки, рівень модифікації яких залежить від стадії розвитку зародків і регулюється інсуліном;
- проаналізовано особливості функціонування інозитліпідної сигнальної системи в клітинах ранніх зародків в’юна та вплив на ці процеси інсуліну та гуанілових нуклеотидів. Вперше встановлено, що G-білки залучені до інсулін-опосередкованого стимулювання активності РІ-4-кінази і негативного регулювання РІ-3-кінази залежно від стадії ембріонального розвитку;
- вперше отримано частково очищені препарати S6-кінази ембріональних клітин, ізольованих на стадії ранньої гаструли, досліджено її деякі фізико-хімічні властивості, субстратну специфічність, динаміку активності та особливості регулювання під впливом EGF.
2. Вперше показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі (Tyr-специфічного фосфорилювання білків, активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ та S6-кінази) є їх системний коливний характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних ПФР (інсуліну і EGF) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних зародках. Висунуто гіпотезу про здатність ПФР не тільки стимулювати проліферацію різних типів клітин, а й пригнічувати сигнальні процеси в стимульованих клітинах у просторово-часовий спосіб.
3. Встановлено, що індукція основних морфогенетичних подій в ранньому ембріогенезі (мезодерми, 10 год розвитку, і нейроектодерми, 13 год розвитку) співпадає з пригніченням біосинтезу ДНК, тирозин-специфічного фосфорилювання білків з Mr 105, 90, 66, 30 і 24 кДа, активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ та зростанням активності S6-кінази і посиленням Tyr-специфічного фосфорилювання білка з Mr 18 кДа. Виявлені особливості динаміки сигнальних процесів вказують на системний характер регулювання сигнальних мереж у ранньому ембріогенезі в’юна.
4. На моделі Ph1-позитивних клітин еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії дерегульованої тирозинової кінази р210Bcr-Abl отримано оригінальні дані про те, що рівень її активності, фосфорилювання білків по тирозину, активність ефекторних білків p21Ras і РІ-3-кінази не підтримуються на постійному конститутивному рівні, а володіють коливним характером залежно від фази росту клітинної культури.
5. Показано, що інгібітор тирозинових протеїнкіназ гербіміцин А, індукує еритроїдну диференціацію і викликає пригнічення росту клітин К562, пов’язане, в значній мірі, зі зниженням життєздатності клітин (на 22 %) внаслідок включення апоптичної програми. Індуктор мегакаріоцитної диференціації, пухлинний промотор РМА, також викликає значне зниження клітинного росту (на 67 %), яке не супроводжується індукцією апоптозу.
6. Встановлено, що гербіміцин А індукує тимчасові координовані зміни активності ключових ефекторних ланок р210Bcr-Abl, активацію p21Ras та інгібування активності РІ-3-кінази на 3 год еритроїдної диференціації клітин К562. Подібні зміни активності РІ-3-кінази спостерігаються і в процесі мегакаріоцитної диференціації, індукованої РМА.
7. Показано, що осциляції перебігу сигнальних процесів у лейкемічних клітинах К562 корелюють зі змінами р210Bcr-Abl-залежних надмолекулярних комплексів, до складу яких входять адаптерні білки Cbl, Grb2, Shc і р85 регуляторна субодиниця РІ-3-кінази.
8. Динамічні системні зміни стехіометрії адаптерних білків Grb2, Shc, с-Cbl і р85 регуляторної субодиниці РІ-3-кінази у Bcr-Abl-опосередкованих надмолекулярних комплексах визначають рівень Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигналювання в процесі еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації клітин К562.
9. Встановлено, що профілі експресії ізоформ Ruk та його ортолога у людини, білка CIN85, їхня субклітинна локалізація та здатність до олігомеризації є специфічними для кожної з досліджених ліній клітин (NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549, U937). Виявлені зокономірності відображають різну біологічну роль ізоформ Ruk/CIN85 в клітинах різного видового та тканевого походження.
10. Ідентифіковано р85 регуляторну субодиницю РІ-3-кінази, як зв’язувальний партнер адаптерного білка Ruk. Показано, що взаємодія між двома білками носить комплексний характер і опосередковується SH3-доменами і Pro-багатими ділянками як Ruk, так і р85.
12. У системі in vitro, з використанням очищених бакуловірусних препаратів РІ-3-кінази і Ruk показано, що здатність адаптерного білка інгібувати активність ліпідкінази залежить від стехіометрії Ruk у надмолекулярному комплексі. Максимальний інгібуючий ефект Ruk виявляється при еквімолярному співвідношенні сигнальних білків у комплексі.
13. Продемонстровано, що адаптерний білок Ruk може утворювати комплекси з ендонуклеазою(ами) в клітинах лінії НЕК293 ембріональної нирки людини. Виявлена нуклеазна активність є Мg2+, Ca2+-залежною і інгібується іонами Zn2+ та гепарином. Встановлено, що взаємодія з ендонуклеазою опосередковується С-кінцевим суперспіралізованим районом Ruk.
14. З’ясовано механізми внутрішньо- та міжмолекулярних взаємодій, опосередкованих доменами і мотивами Ruk. Виявлення осциляцій у здатності пролін-багатих мотивів Ruk взаємодіяти з екзогеннними партнерами в процесі TNF-ідукованого апоптозу клітин U937 свідчить про існування в клітинах динамічної рівноваги між активними (відкритими) і неактивними (закритими внаслідок внутрішньомолекулярних взаємодій) формами адаптерного білка.
15. Встановлено зниження експресії повнорозмірної форми ортолога Ruk у людини, білка CIN85, у переважній більшості досліджених зразків (у 12 випадках з 20) світлоклітинної карциноми нирки людини.
Дробот Л.Б., Юрженко В.С., Кусень С.И. Эпидермальный фактор роста стимулирует протеинкиназную активность, специфическую к рибосомному белку S6, в бластодерме зародышей в’юна //Молекулярная биология.-1989.-Т.23, №3.-С.872-878.
Дробот Л.Б., Кошельник Ю.Р., Шевчук М.Я., Кусень С.И. Влияние инсулина и гуаниловых нуклеотидов на метаболизм полифосфоинозитидов в плазматических мембранах клеток зародышей вьюна (Misgurnus fossilis L.) //Биологические мембраны.-1991.-Т.8, №10.-С.1066-1074.
Стойка Р.С., Дробот Л.Б., Сушельницкий С.И., Юрженко В.С., Кошельник Ю.Р., Кусень С.И. Ранние эмбриональные клетки вьюна специфически связывают трансформирующий фактор роста типа бетта //Онтогенез.-1993.-Т.24, №1.-С.38-42.
Юрженко В.С., Дробот Л.Б., Барсук Л.С., Кусень С.И. Функциональная активность рецепторов эпидермального роста в клетках ранних зародышей вьюна //Онтогенез.-1993.-Т.24, №3.-С.70-80.
Drobot L.B., Yurzhenko V.S., Koshelnik Yu.R., Kusen S.I. Identification and characterization of insulin and epidermal growth factor receptors in loach embryonic cells //Biol. Mem.-1994.-Vol.7, №3.-P.291-299.
Drobot L.B., Koshelnick Yu.R., Kusen S.I. GTP-binding proteins in plasma membranes of loach embryonic cells //Membr. And Cell Biol.-1995.-Vol.9, №1.-P.49-56.
Вальовка Т.Й., Філоненко В.В., Пальчевський С.С., Великий М.М., Дробот Л.Б., Вотерфілд М., Мацука Г.Х., Гут І.Т. Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу бетта //Биополимеры и клетка.-1999.-Т.15, №5.-С.415-421.
10. Вальовка Т.Й., Філоненко В.В., Великий М.М., Дробот Л.Б., Вотерфілд М., Мацука Г.Х., Гут І.Т. Особливості фібронектинзалежної активації кіназ рибосомного білка S6 (S6K1 і S6K2) //Укр. біохім. журн.-2000.-Т.72, №3.-С.31-37.
Ільницька О.М., Паливода О.Ю., Гусак Д.М., Вальовка Т.Й., Ігуменцева Н.І., Кусень С.Й., Дробот Л.Б. Аналіз білок-білкових взаємодій, опосередкованих адаптерним білком Grb2, в процесі мегакаріоцитної диференціації клітин еритролейкемії людини лінії К562 //Біополімери і клітина.-1999.-Т.15, №6.-С.501-507.
Gout I., Middleton G., Adu J., Ninkina N.N., Drobot L.B., Filonenko V., Matsuka G., Davies A.M., Waterfield M., Buchman V.L. Negative regulation of PI 3-kinase by Ruk, a novel adaptor protein//EMBO J.-2000.-Vol.19, №15.-P.4015-4025.
Rzeszowska-Wolny J., Drobot L. Sygnalizacja i zmiany funkcjonowania komorki po uszkodzeniu DNA /In: Na pograniczu chemii I biologii.-Poznan: Wydawnictwo Naukowe UAM.-2003.-T. IV.-S.231-252.
Ільницька О.М., Мазур І.Я., Ігуменцева Н.І., Дробот Л.Б. Вивчення регуляції фосфатидилінозит-3-кіназного шляху в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин еритролейкемії лінії К562 //Укр. біохім. журн.-2001.-Т.73, №2.-С.31-33.
Ільницька О.М., Олексин Г.О., Кусень С.Й., Дробот Л.Б. Регуляція активності фосфатидилінозит-3-кінази в процесі мегакаріоцитної диференціації клітин еритролейкемії людини, індукованої форбол-12-міристат-13-ацетатом //Біополімери і клітина.-2002.-Т.18.-№2.-С.110-114.
Ільницька О.М., Олексин О.Г., Кусень С.Й., Дробот Л.Б. Динаміка процесів диференціації і апоптозу в клітинах еритролейкемії людини лінії К562, індукованих інгібіторами тирозинових протеїнкіназ гербіміцином А і кверцетином //Медична хімія-2002.-Т.4, №4.-С.13-17.
Кіт Ю.Я., Шуваєва Г.Ю., Дрель В.Р., Ігуменцева Н.І., Дробот Л.Б. Дослідження експресії дезоксирибонуклеаз у клітинах ссавців методом ренатурації білків у поліакриламідному гелі //Укр. біохім. журн.-2002.-Т.74, №3.-С.100-103.
Кіт Ю., Шуваєва Г., Дрель В., Ігуменцева Н., Дробот Л. Дослідження нуклеазної активності клітинних лізатів методом ренатурації білків у поліакриламідному гелі // Вісник Львів. Ун-ту.-2002.-Т.28.-С.28-33.
Verdier F., Valovka T., Zhyvoloup A., Drobot L.B., Buchman V., Waterfield M., Gout I. Ruk is ubiquitinated but not degraded by proteasome //Eur. J. Biochem.-2002.-Vol.269, №14.-P.3402-3408.
Kit Yu.Ya., Drel V.R., Petriv O.I., Kovalyova V.A., Shuvayeva G.Yu., Palivoda O.Yu., Vovk E.I., Bobak Ya.P., Rzeszowska-Wolny J., Gout I.T., Buchman V.L., Drobot L.B. Adaptor protein Rukl forms protein-protein complexes with endonuclease activity in HEK293 cells //Biochemistry (Moscow).-2003.-Vol.68, №7.-P.810-815.
Czajkowski R., Banachewicz W., Ilnytska O., Drobot L.B., Baranska J. Differential effects of P2Y1 and P2Y12 nucleotide receptors on ERK1/ERK2 and phosphatidylinositol 3-kinase signalling and cell proliferation in serum-deprived and nonstarved glioma C6 cells //Br. J. Pharm.-2004.-Vol.141, №3.-P.497-507.
Borthwick E.B., Korobko I.V., Courtney L., Drel V.R., Fedyshyn Ya.Ya., Ninkina N., Drobot L.B., Buchman V.L. Multiple domains of Ruk/CIN85/SETA/CD2BP3 are involved in interaction with p85 regulatory subunit of PI 3-kinase //J. Mol. Biol.-2004.-Vol.343, №4.-P.1135-1146.
Дробот Л.Б., Петрів О.І., Кіт Ю.Я., Дрель В.Р., Гут І.Т. Вплив адаптерного білка RukL на активність фосфатидилінозит-3-кінази за умов in vitro //Експ. та клін. фізіол. і біохім.-2004.-Т.7, №4.-С.50-59.
Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Маєвська О.М., Ігуменцева Н.І., Ржепецький Ю.А., Машталір Н.Б., Поспішіль Ю.О., Шуляк О.В., Возіанов С.О., Дробот Л.Б. Експресія адаптерного білка CIN85/Ruk в пухлинах нирки людини //Експ. та клін. фізіол. і біохім.-2004.-Т.7, №4.-С.93-99.
Ilnytska O.M., Drel’ V.R., Shuvayeva H.Yu., Havrylov S.V., Fedyshyn Ya.Ya., Mayevska O.M., Ihumentseva N.I., Gout I.T., Buchman V.L., Drobot L.B. Intra- and intermolecular interactions mediated by adaptor protein Ruk/CIN85/SETA //Biopolymers and Cell.-2005.-Vol. 21, №1.-P.48-54.
Drobot L., Husak Z., Ilnytska O., Igumentseva N., Oleksyn H., Kusen’ S. Transient activation of Ras-dependent signalling at the early stages of Herbimycin A-induced erythroid differentiation of human erythroleukemia K562 cells //Experimental Oncology.-2005.-Vol. 27, №1.-P.31-37.
Дробот Л.Б., Маєвська О.М., Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Барська М.Л., Ігуменцева Н.І., Басараба О.І., Федорко О.І. Поліклональні та моноклональні антитіла проти адаптерного Ruk/CIN85 білка: отримання, характеристика, можливості застосування //В зб.: Фундаментальні орієнтири науки (Біологія та науки про Землю і навколишнє середовище).-К.: Академперіодика.-2005.-С.105-118.
Drobot L.B., Koshelnik Yu.R., Kusen S.I. GTPgS potentiate inhibition of phosphatidylinositol -3’ kinase by insulin in loach embryo cells //Abstracts of 14th Joint Meeting of British Endocrine Societies/1st Joint Meeting with European Federation of Endocrine Societies.-Warwick (Great Britain).-1995.-P.143.
Drobot L.B., Koshelnik Yu.R., Kusen S.I. Enhancement or inhibition of insulin signalling in loach embryonic cells is dependent on stage of development //Abstracts of the Congress of the European Developmental Biology Organization (EDBC-1995).-Toulouse (France).-1995.-P.77.
Drobot L. Ruk/CIN85 scaffolding adaptor protein: structural features and role in the signal transduction //Abstracts of 1st (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology.-Lviv (Ukraine).-2004.-P.14.
Drobot L.B. Expression profiles of Ruk/CIN85 adaptor/scaffold protein isoforms in human tumors //Ukr.Biokhim.Zh.-Abstracts of 5th Parnas Conference.-Kiev (Ukraine).-2005.-P. 19.
Havrylov S., Czajkowski R., Drobot L., Baranska J. Complex pattern of RUK/CIN85 adaptor localization //FEBS Lett.-Abstracts of 30th FBS congress and 9th IUBMB Conference.-Budapest (Hungary).-2005.-P.320.
