311. Шелудько Юрій Всеволодович. Отримання та фітохімічний аналіз трансгенної кореневої культури Rauvolfia serpentina як джерела нових індольних алкалоїдів: дис... канд. біол. наук: 03.00.20 / НАН України; Інститут клітинної біології і генетичної інженерії. - К., 2004.
Анотація до роботи:
Шелудько Ю.В. Отримання та фітохімічний аналіз трансгенної кореневої культури Rauvolfia serpentina як джерела нових індольних алкалоїдів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004.
Дисертація присвячена дослідженю складу індольних алкалоїдів в культурі трансгенних коренів “hairy roots” раувольфії зміїної (Rauvolfia serpentina Benth. ex Kurz). Шляхом трансформації, опосередкованої Agrobacterium rhizogenes, було отримано трансгенну кореневу культуру R. serpentina. Факт стабільної інтеграції Т-ДНК в геном раувольфії було підтверджено комплексом біохімічних і молекулярно-біологічних аналізів. Для проведення аналізу складу індольних алкалоїдів в тканині трансгенних коренів було розроблено схему екстракції і хроматографічного розділення алкалоїдів. Із тканини трансгенних коренів було виділено 16 відомих алкалоїдів, 9 з яких було зареєстровано в складі екстрактів трансгенної кореневої культури R.serpentina в перший раз: стриктозидин, стриктозидин лактам, ізомери валезіахотамину, велозимін, сарпагін, нораймалін, 17-О-ацетилаймалін, раукафринолін і тетрагідроальстонін. Новий iндольний алкалоїд групи раумакліну, 10-гідрокси-N(a)-деметил-19,20-дегідрораумаклін, і три нових алкалоїди групи сарпагіну, 19(S),20(R)-дигідропераксин, 19(S),20(R)-дигідропераксин-17-аль та 10-гідрокси-19(S),20(R)-дигідропераксин, було знайдено в екстрактах трансгенних коренів і визначено їх структури. Було запропоновано схему біогенетичного походження 10-гідрокси-N(a)-деметил-19,20-дегідрораумакліну від алкалоїду воміленину. Інкубування імовірного попередника нових алкалоїдів сарпагінової групи з екстрактом ферментів тpансгенної кореневої культури R. serpentina показало, що 19(S),20(R)-дигідропераксин-17-аль і 19(S),20(R)-дигідропераксин утворюються в результаті ензиматичного перетворення раукафриноліну. Було запропоновано схему біосинтезу нових сарпагінових алкалоїдів із раукафриноліну. Досліджували вплив метилжасмонату на вміст індольних алкалоїдів в тpансгенних коренях R. serpentina. Обробка метилжасмонатом призвела до зростання вмісту алкалоїдів в тканині в 2-8 разів. Концентрація одного з найбільш цінних алкалоїдів раувольфії – аймаліну – збільшилась вдвічі, досягнувши 0,6 % с. в.
Шляхом трансформації з використанням Agrobacterium rhizogenes отримано трансгенну кореневу культуру “hairy roots” раувольфії зміїної (Rauvolfia serpentina Benth. ex Kurz) - пpодуцента великої гpупи фармакологічно-цінних iндольних алкалоїдiв, яка росла на безгормональному живильному середовищі з періодом подвоювання біомаси 7-8 діб.
Факт стабільної інтеграції Т-ДНК в геном раувольфії було підтверджено комплексом біохімічних і молекулярно-біологічних аналізів, в тому числі електрофоретичним аналізом опінів на папері, блот-гібридизацією за Саузерном та полімеразною ланцюговою реакцією.
Проведено фітохімічний аналіз екстрактів тканини трансгенних коренів. Розроблено схему екстракції і хроматографічного розділення алкалоїдів з використанням методів "швидкої хроматографії" на колонці з силікагелем і препаративної ХТШ.
Із тканини трансгенних коренів було виділено 16 відомих алкалоїдів, 9 з яких було зареєстровано в складі екстрактів трансгенної кореневої культури R.serpentina в перший раз: стриктозидин, стриктозидин лактам, ізомери валезіахотамину, велозимін, сарпагін, нораймалін, 17-О-ацетилаймалін, раукафринолін і тетрагідроальстонін.
Новий iндольний алкалоїд 10-гідрокси-N(a)-деметил-19,20-дегідрораумаклін, який є першим природним представником рідкісної групи раумаклінів, було знайдено в екстрактах тканини культури і визначено його структуру. Розроблено схему його препаративного виділення. Доведено, що алкалоїд існує у розчині у вигляді суміші E- і Z-ізомерів.
Ґрунтуючись на специфічних особливостях структури нового алкалоїду, а саме невідновленому, на відміну від аймалінових алкалоїдів, 19-20 зв’язку і відсутності метильної групи при N(a), вперше було запропоновано схему біогенетичного походження 10-гідрокси-N(a)-деметил-19,20-дегідрораумакліну від індоленінового алкалоїду воміленину, який є одним із ключових попередників аймаліну.
Вперше ізольовано три нових алкалоїди сарпагінової групи: 19(S),20(R)-дигідропераксин, 19(S),20(R)-дигідропераксин-17-аль та 10-гідрокси-19(S),20(R)-дигідропераксин. Розроблено схеми їх препаративного виділення. Методами ЯМР аналізу визначено їх структури.
Інкубування раукафриноліну з екстрактом ферментів тpансгенної кореневої культури R. serpentina вперше показало, що 19(S),20(R)-дигідропераксин-17-аль і 19(S),20(R)-дигідропераксин є натуральними компонентами екстракту алкалоїдів тpансгенної кореневої культури R serpentina, які утворюються в результаті ензиматичного перетворення раукафриноліну, а не є продуктами спонтанного деацетилювання раукафриноліну або перакіну в процесі екстракції. Вперше запропоновано схему біосинтезу нових сарпагінових алкалоїдів із раукафриноліну.
Вперше досліджено вплив метилжасмонату на вміст індольних алкалоїдів в тpансгенній кореневій культурі R. serpentina. ВРХ-аналіз екстрактів трансгенних коренів показав, що обробка метилжасмонатом призвела до зростання вмісту алкалоїдів в тканині в 2-8 разів при незначному (близько 26 %) інгибуванні прирісту біомаси. Концентрація одного з найбільш цінних алкалоїдів раувольфії – аймаліну – становила в екстрактах тканини контрольних культур близько 0,3 % с. в. і збільшилась вдвічі після обробки метилжасмонатом, досягнувши 0,6 % с. в.
