Анотація до роботи:

Кіщенко О.М. Отримання трансгенних рослин цукрового буряку та вивчення експресії перенесених генів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2006.

В дисертаційній роботі запропоновано нові підходи отримання трансгенних рослин цукрового буряку за допомогою Agrobacterium rhizogenes та A. tumefaciens. В результаті серії проведених дослідів підібрано умови процесу трансформації, оптимальна система регенерації та придатна стратегія селекції трансформованих клітин цукрового буряку.

Показана можливість отримання в результаті трансформації A. rhizogenes трансгенних рослин цукрового буряку шляхом прямої регенерації без стадії «бородатих коренів». Отримані трансгенні рослини мають нормальний фенотип і містять лише Т-ДНК бінарного вектору.

Розроблено нову високоефективну та відтворювану методику генетичної трансформації цукрового буряку за допомогою A. tumefaciens шляхом вакуум-інфільтрації етиольованих проростків. Отримано трансгенні рослини цукрового буряку ліній запилювачів О-типу української селекції з використанням різних селективних маркерних генів, а саме генів стійкості до антибіотиків канаміцину і гігроміцину В та гербіциду фосфінотрицину.

Шляхом агробактеріальної трансформації цукрового буряку конструкцією, яка містить lox сайт, розташований між правою послідовністю, що обмежує Т-ДНК, та стартовим кодоном безпромоторного bar гену, були отримані трансгенні рослини, стійкі до фосфінотрицину як в умовах in vitro, так і ex vitro. Експериментально доведено, що в отриманих трансгенних рослинах цукрового буряку, які містять lox сайт перед послідовністю без промотору, яка кодує ген bar, відбувається транскрипція bar гену.

В результаті агробактеріальної трансформації отримано трансгенні рослини цукрового буряку, які містять функціональну Spm/dSpm систему транспозонів кукурудзи. Показано, що гетерологічна система мобільних елементів зберігає активність в геномі цукрового буряку.

Розроблено ефективну систему генетичної трансформації цукрового буряку за допомогою агробактерій. Досліджено експресію перенесених генів в отриманих трансгенних рослинах та клітинних лініях цукрового буряка.

1. Запропоновано новий підхід отримання трансгенних рослин цукрового буряку за допомогою Agrobacterium rhizogenes шляхом прямої регенерації без стадії «бородатих коренів». Показано, що отримані після трансформації A. rhizogenes трансгенні рослин цукрового буряку містять лише Т-ДНК бінарного вектору.

2. Стабільну експресію гену nptII було виявлено в трансгенних культурах «бородатих коренів» та рослинах, які було отримано після генетичної трансформації за допомогою A. rhizogenes. Експресія перенесеного репортерного гену gusA спостерігалася у 90% культур «бородатих коренів» та 25% трансгенних рослин. Експресія гену b-глюкуронідази відбувалася в первинному калюсі, який був ініційований по зрізах черешків GUS-негативних трансгенних рослин.

3. Виявлено, що процес ініціації «бородатих коренів» цукрового буряку після трансформації A. rhizogenes більш чутливий до селективних агентів, ніж ріст кореневої культури.

4. Розроблено нову високоефективну та відтворювану методику генетичної трансформації цукрового буряку за допомогою A. tumefaciens шляхом вакуум-інфільтрації етиольованих проростків. Отримано трансгенні рослини цукрового буряку ліній запилювачів О-типу з використанням різних селективних маркерних генів, а саме генів стійкості до антибіотиків канаміцину та гігроміцину В і гербіциду фосфінотрицину.

5. Використання lox сайту Cre/lox системи рекомбінації бактеріофагу Р1, який розташовано між правою послідовністю, що обмежує Т-ДНК, та безпромоторним bar геном в генно-інженерних конструкціях, дозволяє з високою частотою отримувати фосфінотрицинстійкі рослини цукрового буряку шляхом агробактеріальної трансформації.

6. Експериментально доведено, що в трансгенних рослинах цукрового буряку, отриманих в результаті генетичної трансформації вектором, який містить lox сайт між правою послідовністю, що обмежує Т-ДНК, та геном bar без промотору, відбувається транскрипція гену bar.

7. Вперше отримано трансгенні рослини цукрового буряку, які містять функціональну Spm/dSpm систему транспозонів кукурудзи. Показано, що гетерологічна система мобільних елементів зберігає активність в геномі цукрового буряку.

Публікації автора:

1. Кіщенко О.М., Комарницький І.К., Глеба Ю.Ю., Кучук М.В. Отримання трансгенних рослин цукрового буряку (Beta vulgaris L.) ліній О-типу за допомогою Agrobacterium tumefaciens // Цитология и генетика. – 2004. – Т. 38, №5. – С. 3-8.

2. Кищенко Е.М., Кучук Н.В. Влияние экзогенных углеводов на эффективность генетической трансформации табака и сахарной свеклы с помощью Agrobacterium tumefaciens // Физиология и биохимия культ. растений. – 2005. – Т. 37, №2. – С. 160-166.

3. Kishchenko E.M., Komarnitskii I.K., Kuchuk N.V. Production of transgenic sugarbeet (Beta vulgaris L.) plants resistant to phosphinothricin // Cell Biol. Int. - 2005. – Vol. 29, №1. – Р. 15-19.

4. Кищенко Е.М., Комарницкий И.К., Кучук Н.В. Получение трансгенных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) с помощью Agrobacterium rhizogenes // Цитология и генетика. – 2005. – Т. 39, №1. – С. 9-13.

5. Kishchenko E.M., Gleba Yu.Yu., Kuchuk N.V. Sugarbeet (Beta vulgaris L.) transformation by Agrobacterium rhizogenes // Материалы Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология». - Минск, 1998. - С. 202.

6. Kishchenko E.M., Gleba Yu.Yu., Kuchuk N.V. Recovery of transgenic plants after transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) with Agrobacterium rhizogenes // Abstracts of II International Symposium on Plant Biotechnology. – Kyiv, 1998. - P. 54.

7. Kishchenko E.M., Gleba Yu.Yu., Kuchuk N.V. Transformation of sugarbeet regenerable callus with Agrobacterium tumefaciens // Abstracts of II International Symposium on Plant Biotechnology. – Kyiv, 1998. - P. 55.

8. Кищенко Е.М. Генетическая трансформация сахарной свеклы с помощью Agrobacterium rhizogenes // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых учених «Биотехнология – возрождению сельского хозяйства России в ХХІ веке». – Санкт-Петербург, 2001. – С. 35-38.

9. Кіщенко О.М., Комарницькій І.К. Отримання трансгенних ліній цукрового буряку (Beta vulgaris L.), стійких до фосфінотрицину // Тези доповідей Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології. – Львів, 2004. – С. 91.

10. Кіщенко О.М. Отримання трансгенних рослин цукрового буряку, які містять Spm/dSpm систему транспозонів // Тези доповідей ІХ конференції молодих дослідників. – Київ, 2005. – С. 71.

11. Кіщенко О.М., Комарницький І.К., Кучук М.В. Генетично-модифіковані цукрові буряки // Тези доповідей Міжнар. науково-практичної конф. «Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання». - Оброшино, 2005. – С. 214.

12. Kishchenko E.M., Komarnitskii I.K., Kuchuk N.V. Transposition and behavior of the maize transposable system Spm/dSpm in transgenic sugarbeet // Book of Abstracts of the 6^th International Symposium in the Series Recent Advances in Plant Biotechnilogy «From Laboratory to Business». - Иeskл Budмjovice (Czech Republic), 2005. - Р. 44.