Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07. – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.
Дисертація присвячена виділенню та дослідженню властивостей позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази (ФБФази) Bacillus subtilis 668.
Розроблено спосіб очищення цього ферменту за допомогою фракціонування сульфатом амонію її препаратів з культуральної рідини, та гідрофобної та субстратзалежної хроматографії . Встановлено вплив джерел вуглецю і температури на динаміку накопичення і активність ферменту. Здійснена очистка у 165 разів до гомогенного стану та отримано ферментний препарат позаклітинної ФБФази з активністю 52,9 од/мг білку.
Досліджені фізико–хімічні та молекулярні властивості, кінетичні параметри взаємодії позаклітинної ФБФази з субстратом з метою класифікувати фермент. Встановлено, що позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 відноситься до “лужних” фосфатаз, активність якої залежить від двохвалентних катіонів металів та регулюється АМФ і ФЕП. Позаклітинна ФБФаза – тетраметр, з молекулярною масою субодиниці 630000 Да. Чутливість ФБФази В. subtilis 668 до дії АМФ, ФЕП, двовалентних і моновалентних катіонів, розміру субодиниці та інших факторів дали підставу віднести її до ІІІ класу ФБФаз.
Встановлено серологічну спорідненість між позаклітинними ФБФазами B. subtilis 668 та молікута Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118, що підтверджує філогенетичні зв”язки цих мікроорганізмів. Показано, що позаклітинна і клітинна ФБФази B. subtilis 668 серологічно ідентичні.
Виявлено цитотоксичну активність in vitro позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 відносно пухлинних клітин саркоми 37.Даний ферментний препарат знімає пухлиноасоційовані антигени з поверні клітини.
1. Вперше у представника спороносних бактерій – Bacillus subtilis 668 виявлено здатність продукувати у середовище культивування фермент, класифікований як фруктозо-1,6-бісфосфатаза.
2. Позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 очищена у 165 разів до гомогенного стану і має питому активністю 52,9 од/мг білку.
3. Встановлено, що позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 має молекулярну масу 230000±5000 Да в нативному стані і є тетраметром, що складається з рівноцінних субодиниць з молекулярною масою 63 000 Да.
Показано, що позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 має високу афінність і специфічність до субстрату, що доведено за допомогою субстратзалежної елюції. Її активність залежить від наявності двовалентних катіонів та регулюється фосфоенолпіруватом та АМФ.
Чутливість ФБФази В. subtilis 668 до дії АМФ, ФЕП, двовалентних і моновалентних катіонів, молекулярна вага дали підставу віднести її до ІІІ класу ФБФаз. Вона віднесена до групи “лужних” ФБФаз.
Визначено, що за серологічними, фізико–хімічними і молекулярними властивостями позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 є подібною тій, що функціонує в клітині, забезпечуючи основні етапи гліколізу і глюконеогенезу.
Порівняльним вивченням серологічних властивостей встановлено, що ФБФази В. subtilis 668 і його філогенетичного нащадка молікута A. laidlawii var. granulum шт.118 подібні, але не ідентичні, що вказує на зміну фенотипових ознак цих мікроорганізмів в процесі еволюції.
Вперше встановлено цитотоксичну активність in vitro позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 відносно клітин саркоми 37. Її препарати знімають пухлиноасоційовані антигени з поверхні клітини.
9. Запропонований метод одержання препаратів позаклітинної ФБФази В. subtilis 668 створює можливість її біотехнологічного напрацювання в необхідних кількостях для наукових цілей, відпрацювання способів регуляції її активності у людей хворих на діабет ІІ–типу, та вирішення проблем злоякісного росту клітин.
Публікації автора:
Панченко Л.П., Ястребова О.В., Скрипаль І.Г. Позаклітинна фруктозобісфосфатаза Вacillus subtilis: виділення та очищення // Допов. нац. акад. наук Укр. – 2006.- № 6 – с.171 – 174. (Здобувачем особисто проведено виділення і очистка препарату ферменту з культурального фільтрату, підготовлено матеріали статті до друку).
Yastrebova O.V., Panchenko L.P., Korobkova K.S., Skripal’ I.G. Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus subtilis: purification and some properties // Наук. вісн. Ужгород. універ., сер. Біологія.–2006. – вип. 18. – стор. 187-191. (Здобувачем особисто проведено виділення і очистка препарату ферменту з середовища культивування, досліджено вплив деяких інгібіторів і активаторів на ферментативну активність позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази Bacillus subtilis, проаналізовано отримані результати, підготовлено матеріали статті до друку).
Ястребова О.В., Панченко Л.П., Коробкова К.С., Скрипаль І.Г. Молекулярні та імунологічні властивості позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази Bacillus subtilis // Наук. вісник Чернівец. універ. – 2006. – вип. 297. – стор.143–149. (Здобувач безпосередньо приймав участь у плануванні експерименту, та обробляв отримані дані, досліджено деякі імунологічні властивості позаклітинного ферменту, встановлено молекулярні властивості в нативних і денатурованих умовах).
4. Скрипаль І. Г., Малиновська Л.П., Токовенко І.П., Ястребова О.В.,Панченко Л.П. Порівняльне вивчення фруктозобісфосфатаз Bacillus subtilis та збудника блідо–зеленої карликовості зернових культур в реакції подвійної дифузії в гелі за Оухтерлоні // Мікробіол. журн. – 2007. – т. 69, № 2. – с. 9–15. (Здобувач безпосередньо приймав участь у плануванні експерименту, проводив вакцинацію тварин, особисто проводив реакції подвійної дифузії в гелі за Оухтерлоні).
Діденко Г.В., Дворщенко О.С., Ястребова О.В., Потебня М.Г., Панченко Л.П.,Скрипаль І.Г.Протипухлинні властивості позаклітинної фруктозо–1,6– бісфосфатази Bacillus subtilis 668 та препарату, виділеного з культуральної рідини B. subtilis В 7025 // Мікробіол. журн. – 2007. – т. 69, № 3. – с.68–73. (Здобувачем особисто проведено визначення цитотоксичної активності препаратів позаклітинної ФБФази, підготовлено матеріали статті до друку).
Скрипаль І. Г., Ястребова О. В. Фруктозо-бісфосфатаза мікроорганізмів // Мікробіол. журн. - 2002. - 64, № 2. - С.84-104.
Ястребова О.В. Особливості функціонування у мікроорганізмів фруктозо-1,6-бісфосфатази - головного ферменту глюконеогенезу // Укр. біохім. журн.- 2002.- 74, № 4.- С.24 - 32.
Ястребова О.В., Панченко Л.П., Скрипаль І.Г. Молекулярно–біологічні властивості позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази Bacillus subtilis // Тези. Конференція молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин та біотехнології”, 1-3 грудня 2005р, Ужгород. – Наук. вісн. Ужгород. універ. – 2005. - с. 135.
Ястребова Е.В., Панченко Л.П. Характеристика внеклеточной фруктозобисфосфатазы Bacillus subtilis // Тезисы. 9-я международная Пущинская школа–конференция молодых ученых “Биология - наука XXI века”, 18-22 апреля 2005 г., Пущино. – Сб. тезисов. – с. 106
Yastrebova O.V., Panchenko L.P., Skripal I.G. Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus subtilis: purification and some properties // 5th Parnas conference “Molecular mechanisms of cellular signaling”, 26 – 29 april 2005, Kyiv. - Укр. біохім. журн. – 2005. - т. 77. - с. 152.
И.Г. Скрипаль, Е.С. Коробкова, Л.П. Панченко, Л.П. Малиновская, И.П. Токовенко, Е.В. Ястребова. Внеклеточная фруктозобисфосфатаза моликутов и спороносных бактерий как маркер их филогенетического родства // Материалы научной конференции, посвященной 35-летию со дня организации РУП «Институт защиты растений» НАН Беларуси / 28 февраля – 2 марта 2006 г, Минск. - Сб. научн. трудов. – 2006. - вып. 30, ч. 1. « Стратегия и тактика защиты растений». - стр. 47-52.
12. Панченко Л.П., Ястребова О.В., Коробкова К.С.,Скрипаль І.Г. Вплив окремих ефекторів на ферментативну активність позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази Bacillus subtilis 668 // Матеріали ІХ Українського біохімічного з”їзду, 24 – 27 жовтня 2006р., Харків. – с. 159-160.
13. Ястребова Е.В., Диденко Г.В., Дворщенко Г.С. Цитотоксическая активность внеклеточных фруктозо–1,6–бисфосфатазы Bacillus subtilis 668 и гликопротеида B. subtilis В 7025 // International conference of young researchers IV edition (Chiinv, November 10, 2006.) – Chiinv, Moldova, - 2006, - с. 58.
14. Tokovenko I.P., Skripal I.G., Jastrebova E.V., Malinovskaja L.P., Panchenko L.P. Comparative studing fructosebisphosphatases of the Bacillus subtilis 668 and the activator pale–green dwarf grain crops in reaction of double diffusion in gel by Ouchterlony // International conference of young researchers IV edition (Chiinv, November 10, 2006.) – Chiinv, Moldova, - 2006, - с. 60.
