Анотація до роботи:

Юсова О.І. Регуляція активності плазміну активаторами плазміногена непрямої дії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Київ, 2004.

Дисертацію присвячено дослідженню регуляції активності плазміну в комплексі з активаторами плазміногена – стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c проти плазміногена людини. Обгрунтовано використання комплексів плазмін-стрептокіназа і плазмін-моноклональне антитіло IV-1c як моделей для вивчення загальних принципів регуляції багатофункціональності плазміну на рівні білок-білкових взаємодій.

Встановлено кореляцію між деградацією стрептокінази та зміною властивостей плазміну в плазмін-стрептокіназному комплексі. Показано, що гідроліз стрептокінази до низкомолекулярних фрагментів супроводжується зниженням активаторної активності комплексу по відношенню до плазміногена, тоді як зберігається висока амідазна та низька фібринолітична активність комплексу.

Результати вивчення механізму протекторної дії стрептокінази при інгібуванні плазміну ₂-антиплазміном показали, що вплив стрептокінази на взаємодію інгібітора з ферментом слабшає, якщо активний центр плазміну модифіковано діізопропілфторфосфатом. Обгрунтовано припущення про те, що в процесі комплексоутворення стрептокіназа розміщується в безпосередній близькості від активного центру ферменту, що зумовлює обмеження доступу до нього ₂-антиплазміну.

Показано, що моноклональне антитіло IV-1c здатне змінювати властивості плазміну. Комплекс плазмін-антитіло IV-1c проявляє у порівнянні з вільним плазміном підвищену амідазну та знижену фібринолітичну активності, гідролізує казеїн, фібриноген і активує плазміноген, що знаходиться в комплексі з антитілом IV-1c.

Показано, що Ig G проти стрептокінази, які виділено із сироватки крові пацієнтів після введення їм стрептокінази, інгібують активацію плазміногена стрептокіназою. Розроблено інформативний та високочутливий спосіб визначення кількості антитіл проти стрептокінази.

1. Відомо, що фізіологічна роль плазміну не обмежується виключно фібринолізом. Є припущення, що модуляція субстратної специфічності плазміну відбувається за утворення його комплексів з регуляторними білками. Нами вивчено зміну активності плазміну в комплексі з стрептокіназою і моноклональним антитілом IV-1c, які є активаторами плазміногена непрямої дії. Отримані результати мають важливе значення для з'ясування механізмів регуляції багатофункціональності плазміну на рівні білок-білкових взаємодій.

2. Визначено амінокислотну послідовність Асн711-Глі718 в серин-протеїназному домені плазміну, що регулює його каталітичну активність при взаємодії плазміну з стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c.

3. Виявлено, що плазмін у комплексі з антитілом IV-1c, на відміну від плазмін-стрептокіназного комплексу, гідролізує казеїн і фібриноген та є частково захищеним від дії ₂-антиплазміну. Це свідчить про те, що в комплексі з антитілом область активного центру ферменту залишається відкритою. Зниження фібринолітичної активності плазміну у комплексі з антитілом IV-1c пояснюється впливом антитіла на взаємодію плазміну з фібрином.

4. Встановлено, що комплекс плазмін-моноклональне антитіло IV-1c не активує плазміноген людини, але активує профермент, що знаходиться в комплексі з цим антитілом.

5. Встановлено механізм протекторної дії стрептокінази, який полягає в тому, що стрептокіназа перешкоджає зв'язуванню ₂-антиплазміну з плазміном, ефективно конкуруючи за серин-протеїназний домен ферменту і розташовується в контактній зоні активного центру ферменту.

6. Показано, що обмежений протеоліз стрептокінази в комплексі з плазміном приводить до зниження здатності комплексу активувати плазміноген, що пояснюється порушенням структури центру зв’язування субстратного плазміногена. Обмежений протеоліз не впливає на амідазну та фібринолітичну активність комплексу: фрагменти стрептокінази залишаються зв'язаними з плазміном і стабілізують область активного центру ферменту.

7. Фрагмент стрептокінази, у якого відсутні 7 кДа N-кінцевий та 4 кДа С- кінцевий пептиди, втрачає здатність змінювати каталітичні властивості і специфічність дії плазміну, що свідчить про важливу роль цих ділянок молекули стрептокінази в модифікації активного центру плазміну.

8. Розроблено спосіб визначення концентрації антитіл проти стрептокінази в сироватці крові людини, заснований на інгібуванні ними активації плазміногена стрептокіназою і визначенні амідазної та фібринолітичної активності плазміну, що утворюється. Цей спосіб запропоновано для використання в клінічній практиці за тромболітичної терапії стрептокіназою.

Публікації автора:

1. Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Седерхольм-Вільямс С.А. // Деградація стрептокінази та каталітичні властивості плазмін-стрептокіназного комплексу // Укр.біохім.журн. – 2002. – 74,№2. - С.50-57.

2. Гриненко Т.В., Макогоненко Е.М., Юсова Е.И., Скоморовская-Прокволит Е.В., Седерхольм-Вильямс С.А., Колесникова И.Н. Модифицирующее действие антиплазминогенового моноклонального антитела IV-1c на каталитические свойства плазмина человека. // Укр.біохім.журн. – 2002. – 74,№4. С.61-70.

3. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Влияние стрептокиназы на взаимодействие альфа-2-антиплазмина с различными участками молекулы плазмина // Укр.біохім.журн. – 2004. – 76, №2. С. 98-106.

4. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Способ определения количества антистрептокиназных антител // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, Випуск 31. – Матеріали міжнародного симпозіума “Гемостаз – проблеми та перспективи”, 5-6 листопада 2002 року, Київ. – С.345-350.

5. Grinenko T., Slominski A., Makogonenko E., Skomorovskaya–Prokvolit E., Yusova Е., Cederholm–Williams S. Catalytic properties of plasmin in complex with antiplasminogen monoclonal antibody IV-1c. // Fibrinolysis & Proteolysis, Hamamatsu, Japan, June 25th – 29th 2000. – P.91.

6. Юсова О.І. Зміна каталітичних властивостей плазмін-стрептокіназного комплексу за обмеженого протеолізу стрептокінази // Тези доп. Укр.біохім.журн. - 2002. - 74,№4б. - С.64. (матеріали VIII-го Українського біохімічного з’їзду).

7. Grinenko T.V., Volkov G.L., Havriliuk O.S., Yusova O.I., Zadorozhnaya M.B. Triple affinity columns package for one step high purification of the alpha-2 plasmin inhibitor and histidine-rich glycoprotein directly from human plasma // Plasma product biotechnology meeting, Curasao, Netherlands Antilles, April 22th-26th 2003. – P.703.

8. Хасянова И.В., Чернышенко Т.М., Савчук А.Н., Краснобрыжая Е.Н., Платонова Т.Н., Юсова Е.И. Изменение в системе гемостаза у пациентов с венозной тромбоэмболией // Науково-практичний журнал „Кровообіг та гемостаз” – Матеріали Першої Української конференції ”Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування”, 27 – 28 травня, 2004 р., Київ. – С.214-215.