Анотація до роботи:

Гриненко Т.В. Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора білогічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2007.

Робота присвячена вивченню механізмів регуляції фібринолітичного процесу. Досліджено взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/ фібрином, її роль в регуляції швидкості гідролізу фібрину.

Визначено відповідність центрів комплексоутворення окремих доменів молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/фібрину. Установлено послідовність взаємодій молекул ферменту та субстрату за участі комплементарних центрів, яка визначає швидкість гідролізу фібрину. Визначено ключові стадії, які ініціюють процес гідролізу фібрину та регулюють його швидкість.

Показано появу нових плазміноген-зв’язувальних центрів на стадії фібрин(оген)олізу – утворення Х-фрагменту. Взаємодія з ними плазміногену змінює його конформацію на просторово витягнуту форму. Запропоновано механізм регуляції швидкості гідролізу фібринового згустка. Згідно з ним зміна конформації Глу-плазміногену забезпечує переміщення проферменту на центри, що існують в молекулах фібрину. В такий спосіб відбувається підвищення локальної концентрації плазміногену, збільшення швидкості його активації та швидкості гідролізу фібрину плазміном, що утворюється.

Установлено, що a₂-антиплазмін контролює швидкість гідролізу фібрину, пригнічуючи активацію плазміногену тканинним активатором.

Установлено, що всі етапи процесу фібринолізу: білок-білкові взаємодії, активація, інгібування, гідроліз фібрину регулюються некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну. Обгрунтовано, що функціональна активність плазміногену/плазміну визначається структурними відмінностями центрів зв’язування кринглових доменів, злагодженою одночасною дією декількох центрів зв’язування, конформаційною мінливістю молекули та можливістю переключенням внутрішньомолекулярних взаємодій на міжмолекулярні.

1. Функціонування фібринолітичної системи базується на високоспецифічних білок-білкових взаємодіях, вивчення яких важливе для з’ясування молекулярних механізмів регуляції фібринолізу та загальних принципів функціонування регуляторних протеїназ. Проведені дослідження визначили функціональну роль некаталітичних ділянок певних доменів молекули плазміногену/плазміну на всіх етапах процесу фібринолізу. Установлено, що вони забезпечують взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/фібрином, визначають швидкість процесів активації плазміногену, руйнування фібринового згустка плазміном, інгібування плазміну та зміну його активності.

2. Виявлено, що молекула фібриногену містить центри зв’язування плазміногену, які локалізовані в центральному домені Е та периферичних доменах D. Доведено, що в останніх плазміноген-зв’язувальні центри експонуються в процесі гідролізу молекули фібриногену. Показано, що Глу-плазміноген не взаємодіє з фібриногеном, що обумовлено його закритою конформацією, тоді як Ліз-плазміноген зв’язується з доменом Е фібриногену високоафінними ділянками кринглів 1-3.

3. Вперше вивчено взаємодію Glu-плазміногену з фрагментами фібриногену, що утворюються на всіх етапах його гідролізу, та розраховано константи дисоціації комплексів проферменту з Е- та D-фрагментами фібриногену.

4. Установлено, що під час полімеризації фібрину в D-доменах його молекул експонуються первинні центри зв’язування Глу-плазміногену, комплементарні низькоафінній ділянці крингла 5. Показано, що Ліз-плазміноген взаємодіє з фібрином як високо-, так і низькоафінними ділянками зв’язування в кількості, що на порядок перевищує таку Глу-плазміногену.

5. Показано, що на початкових стадіях гідролізу фібрину при розщепленні aС-доменів в окремих молекулах фібрин-мономеру утворюються нові центри зв’язування плазміногену, комплементарні кринглу 4. Взаємодія з ними викликає конформаційні зміни в молекулі Глу-плазміногену, внаслідок чого ділянки кринглів 1-3 отримують можливість взаємодіяти з фібрином, що приводить до збільшення кількості сорбованого на фібриновому згустку проферменту.

6. Продемонстровано, що на стадії розщеплення aС-доменів молекул фібрину швидкість активації Глу-плазміногену тканинним активатором та гідролізу полімерного фібрину збільшується. Таким чином, стадія утворення Х-фрагментів є ключовою в регуляції швидкості руйнування фібринового згустка фібринолітичною системою.

7. Вперше показано існування неферментативного шляху активації Глу-плазміногену за присутності Е фрагмента фібриногену. Останній викликає в проферменті структурні зміни, внаслідок яких в його протеїназному домені формується активний центр. Проведені дослідження дозволяють віднести Е-фрагмент до активаторів плазміногену непрямої дії.

8. Установлено, що кринглові домени контролюють швидкість процесу активації плазміногену стрептокіназою. Вперше показано, що лізин-зв’язувальні ділянки кринглових доменів беруть участь у всіх етапах процесу активації: утворення еквімолярного комплексу, формування активного центра, взаємодії активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.

9. Запропоновано механізм регуляції активності плазміну в комплексі з стрептокіназою. Він полягає в тому, що частина молекули активатора, який приєднується до протеїназного домену, виконує структурну роль відрізка поліпептидного ланцюга, де має місце делеція амінокислотних залишків. В такий спосіб стрептокіназа обмежує доступ в контактну зону активного центра плазміну просторово витягнутим ділянкам субстратів та інгібіторів і залишає її відкритою для ділянок, структурно подібних до активаційної петлі плазміногену.

10. Вперше установлено, що ₂-антиплазмін є регулятором фібринолітичного процесу. Він контролює швидкість гідролізу полімерного фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.

11. Запропоновано способи кількісного визначення плазміногену, тканинного активатора плазміногену, ₂-антиплазміну та антистрептокіназних антитіл в плазмі крові людини.

Публікації автора:

1. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г. Иммобилизация стрептокиназы на нерастворимых носителях и свойства иммобилизованного белка // Укр. биохим. журн. – 1983. – Т. 55, № 3. – С. 307–310.

2. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Новохатний В.К., Макогоненко Е.М., Кастрикина Т.Ф. Некоторые структурные и функциональные аспекты молекулярного механизма фибринолиза // Вестник АН УССР. – 1984. – № 6. – С. 27–34.

3. Веревка С.В., Кудинов С.А., Гриненко Т.В. Аргинил-связывающие участки плазминогена человека // Докл. АН УССР. – 1985. – Сер. Б, № 1. – С. 53–56.

4. Кудинов С.А., Веревка С.В., Гриненко Т.В. Лигандная специфичность участков белок-белкового взаимодействия молекулы плазминогена человека // Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвертывающей систем крови: Сб. науч. работ. – Минск, 1985. – С. 116–121.

5. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Медведь Л.В. Локализация плазминоген-связывающих участков на молекуле фибриногена и его фрагментах // Докл. АН УССР. – 1986. – Сер. Б, № 4. – С. 70–73.

6. Verevka S.V., Kudinov S.A., Grinenko T.V. Arginil-binding sites of human plasminogen // Thrombosis Research. – 1986. – Vol. 41, № 5. – Р. 689–698.

7. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Кудинов С.А., Медведь Л.В. Плазминоген-связывающие центры молекулы фибриногена, фибрина и продуктов их протеолиза // Биохимия. – 1987. – Т. 52, № 10. – С. 1732–1738.

8. Третьяченко В.Г., Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Связывание К 1-3 и К 4 фрагментов плазминогена, содержащих лизин-связывающие участки, с фибриногеном и его фрагментами // Укр. биохим. журн. – 1988. – Т. 60, № 2.– С. 3–6.

9. Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Третьяченко В.Г. Протеолитическая активность Глу-плазминогена при его взаимодействии с Е-фрагментом фибриногена // Докл. АН УССР. – 1988. – Сер. Б, № 10. – С. 75–78.

10. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г. Изучение взаимодействия Глу- и Лиз-форм плазминогена с фибриногеном // Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий: Сб. науч. работ. – Свердловск. – 1988. – С. 6–13.

11. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Связывание Глу-плазминогена с фибриногеном и продуктами его протеолиза // Биохимия. – 1989. – Т. 54, № 2. – С. 213–220.

12. Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Межбелковые взаимодействия плазминогена и фибриногена/фибрина в процессе фибринолиза // Биохимия животных и человека. – Киев, Наукова думка. – 1989. – Т. 13. – С. 46–55.

13. Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Исследование протеолитической активности комплекса Глу-плазминогена с фрагментом Е фибриногена // Биохимия. – 1991. – Т. 56, № 3. – С. 458–466.

14. Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Характеристика центров комплексообразования между Глу- и Лиз-формами плазминогена и фибриногеном/фибрином // Биохимия животных и человека. – Киев, Наукова думка.– 1991. – Т. 15. – С. 66–76.

15. Золотарева Э.Н., Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Влияние аргинина на гидролиз фибриногена плазмином и мини-плазмином // Укр. биохим. журн. – 1992. – Т. 64, № 1. – С. 3–9.

16. Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Особенности взаимодействия Glu- и Lys-форм плзминогена с нативным и частично гидролизованным фибрином // Биохимия. – 1992. – Т. 57, № 5.– С. 728–737.

17. Золотарева Э.Н., Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Влияние химической модификации остатков аргинина фибриногена и его Dн-фрагмента на скорость гидролиза этих белков плазмином // Укр. биохим. журн. – 1994. – Т. 66, № 2. – С. 79–84.

18. Метелицына И.П., Левицкая Г.В., Гриненко Т.В., Метелицына Т.И. Методы исследования системы фибринолиза и ее компонентов // Укр. биохим. журн. – 1997. – Т. 69, № 5. – С. 33–40.

19. Макогоненко Є.М., Яковлев С.О., Сломінський О.Ю., Корольчук В.І., Гриненко Т.В., Соколовська Л.І., Дружина Н.М., Колесникова І.М., Чернишов В.І., Седерхольм-Вильямс С.А. Активація плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1с. Властивості та механізм реакції // Укр. біохім. журн. – 2000. – Т. 72, № 4-5. – С. 99–108.

20. Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Седерхольм-Вільямс С.А. Деградація стрептокінази та каталітичні властивості плазмін-стрептокіназного комплексу // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 3. – С. 50–57.

21. Гриненко Т.В., Макогоненко Е.М., Юсова Е.И., Скоморовская-Прокволит Е.В., Седерхольм-Вильямс С.А., Колесникова И.Н. Модифицирующее действие антиплазминогенового антитела IV-1с на каталитические свойства плазмина человека // Укр. биохим. журн. – 2002. – Т. 74, № 4. – С. 61–70.

22. Гриненко Т.В., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Макогоненко Є.М. Особливості взаємодії -2-антиплазміну з плазміногеном/плазміном // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 6. – С. 83–90.

23. Соколовська А.С., Платонова Т.М., Гриненко Т.В., Чернишенко Т.М. Порівняльна характеристика методів визначення вмісту фібриногену в плазмі крові // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2002. – № 3 – С. 82–86.

24. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Способ определения количества антистрептокиназных антител // Гематологія і переливання крові: Міжвід.зб. – Київ, 2002 – Т. 31 – С. 345–349.

25. Соколовская Л.И., Макогоненко Е.М., Гриненко Т.В., Седерхольм-Вильямс С.А. Роль лизин-связывающих участков в активации плазминогена стрептокиназой // Укр. биохим. журн. – 2003. – Т. 75, № 2. – С. 25–32.

26. Гриненко Т.В. Альфа-2-антиплазмін інгібує процес активації плазміногена тканинним активатором на фібрині // Кровообіг та гемостаз – 2004 – № 3. – С. 49–50.

27. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Влияние стрептокиназы на взаимодействие -2-антиплазмина с различными участками молекулы плазмина // Укр. биохим. журн. – 2004. – Т. 76, № 2. – С. 98–106.

28. Задорожна М.Б., Гриненко Т.В., Юсова О.І., Волков Г.Л. Зв’язування -2-антиплазміну з фібриногеном/фібрином та їх фрагментами без участі фактора ХІІІ // Укр. біохім. журн. – 2004 – Т. 76, № 5. – С. 42–48.

29. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Платонова Т.М., Волков Г.Л. Інгібування-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині DDЕ-комплексі та DD-димері // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 45–51.

30. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Юсова О.І. Регуляція -2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині // Укр. біохім. журн. – 2006. – Т. 78, № 3 – С. 106–112.

31. Гриненко Т.В., Юсова Е.И., Волков Г.Л. Вплив антистрептокіназних антитіл на активацію плазміногену стрептокіназою та комплексом плазмін-стрептокіназа // Лаб. діагностика. – 2007. – Т. 2, № 40. – С. 60–63.

32. Пат. UA 53146 C2. Спосіб виділення високоочищеного A₂-антиплазміну з плазми крові людини: Пат. UA 53146 C2 Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Волков Г.Л.; Заявл. 22.03.2002; Опубл. 15.01.2003, Бюл. № 1.

33. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Веревка С.В. Влияние аминокапроновой кислоты и аргинина на взаимодействие плазминогена с фибрином и его фрагментами // IV Всесоюзный симпозиум „Инженерная энзимология”. – Киев, 1983. – С. 85.

34. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Кудинов С.А. Локализация плазминоген-связывающих участков на молекуле фибриногена и его фрагментах // IV симпозиум СССР-Италия „Макромолекулы в функционирующей клетке”. – Киев, 1984. – С. 43.

35. Гриненко Т.В., Лежен Т.І. Структурно-функціональні аспекти міжбілкових взаїмодій плазміногену та фібриногену в системі фібринолізу // Тези V Українського біохімічного з’ізду – Івано-Франківськ, 1987. – С. 40.

36. Гриненко Т.В., Скоморовська О.В., Золотарьова Е.М. Вплив появи Х-фрагменту на фібрин-зв’язуючі властивості Глу-плазміногену // Тези VІ Українського біохімічного з’ізду. – Київ, 1992. – С. 90.

37. Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Золотарева Э.Н., Кудинов С.А. Изучение комплексообразования различных форм плазминогена с фибрином // III симпозиум „Химия протеолитических ферментов”.– Москва, 1993. – С. 80.

38. Skomorovskaya E.V., Grinenko T.V., Platonova T.N. Interaction between Glu-plasminogen and Lys-plasminogen with Dн-dimer // Abstracts of XVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, June 11-16, 1995, Jerusalem (Israel) / Thrombosis and Haemostasis. – 1995. – Vol. 73, № 6. – P. 1136.

39. Grinenko T., Slominski A., Makogonenko E., Skomorovskaya- Prokvolit E., Yusova E., Cederholm-Williams S. Catalytic properties of plasmin in complex with antiplasminogen monoclonal antibody IV-1c // Abstracts of XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, June 25-29, 2000, Hamamatsu (Japan) / Fibrinolysis and Proteolysis – 2000. – Vol. 14, № 1. – P. 70.

40. Гриненко Т.В., Семьошкіна Т.В. Швидкість гідролізу фібрину різними формами плазміногену, активованого стрептокіназою за присутності -2-антиплазміну // Тези VIII Українського біохімічного з’їзду, 1-3 жовтня 2002, Чернівці / Укр.біохім.журн. – 2002. – Т.74, № 4Б (додаток 2) – С. 25-26.

41. Grinenko T., Volkov G., Gavriliuk O., Yusova O., Zadorozhnaya M. Triple affinity columns package for step high purificvation of the alpha-2-plasmin inhibitor and histidine-rich glycoprotein directly from human plasma // Abstracts of the second Product biotechnology meeting. – Curasao (Netherlands Antilles), 2003. – Р. 66.

42. Гриненко Т.В., Юсова О.І. Порівняння активаторних та протекторних властивостей нативної стрептокінази та її 36 кДа фрагмента // Матеріали науково-практичної конференції „Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії”, 18-20 2005, Чернівці / Буковинський медичний вісник – 2005. – Т. 9, № 2. – C. 75-76.

43. Grinenko T., Yusova O. Activation of Glu-, Lys- and mini-plasminogen by equimolar quantities of streptokinase 36 kDa fragment and effect of fibrin on this process. // Abstracts of 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, August 21-31, 2006, San Diego (USA) / J. Intern. Soc. Thrombosis and Haemostasis – 2006. – Vol. 4. – P. 191.

44. Гриненко Т.В. Міжбілкові взаємодії плазміногену/плазміну в регуляції фібринолізу // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – С.16.

45. Grinenko T.V., Volkov G.L., Yusova E.I. Influence of the streptokinase 36 kDa fragment on the plasmin activity. // Abstracts of XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, July 6-12, 2007, Geneva (Switzerland) / J. Thromb. and Haemost. – 2007. – Vol 5, Suppl. 2. – P-T-394.