Анотація до роботи:

Спиридонов В.Г. РНК-зв’язувальна активність білка оболонки вірусу мозаїки люцерни в тригібридній системі Saccharomyces cerevisiae. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004.

Дисертаційна робота присвячена вивченню молекулярних особливостей взаємодії білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (ВМЛ) з РНК4, яка кодує цей білок.

В бактеріальній системі експресії одержали рекомбінантний білок оболонки ВМЛ. Комп’ютерний аналіз амінокислотної послідовності виявив, що цей білок має дві амінокислотні заміни (G₁₁₉S та Q₁₅₉R) і коротший за свій природній аналог на три амінокислотні залишки.

Виділений та очищений рекомбінантний білок оболонки ВМЛ використовували для імунізації кролів та одержання поліклональних антитіл. Вестерн-блот аналізом, з використанням афінно-очищених поліклональних антитіл, виявили здатність рекомбінантного білка оболонки ВМЛ до стабільної димеризації в умовах in vitro.

Виявили негативний вплив мутації Q₁₅₉R в послідовності білка оболонки ВМЛ на формування гомодимерів в дріжджовій двогібридній системі in vivo.

За допомогою тригібридної системи вперше показали, що білок оболонки ВМЛ з високою спорідненістю зв’язується з плюс-ланцюгом РНК4 в умовах in vivo.

Мутаційний аналіз функціональної частини білка оболонки ВМЛ виявив, що N-термінальна частина білка оболонки ВМЛ (з 1 по 85 аз) містить РНК-зв’язувальний домен, здатний до активації експресії b-галактозидази в тригібридній системі.

С-термінальна частина білка оболонки ВМЛ (з 86 по 221 аз) безпосередньої участі не приймає у взаємодії з РНК, однак активність b-галактозидази у випадку взаємодії тільки N-кінцевої частини нижче у п’ять разів на відміну від повнорозмірного білка, що може свідчити про те, що третинна структура повнорозмірного білка оболонки ВМЛ сприятливіша для цієї взаємодії.

1. В бактеріальній системі експресії E. coli одержано рекомбінантний білок оболонки вірусу мозаїки люцерни (ВМЛ). Комп’ютерний аналіз амінокислотної послідовності показав, що цей білок має дві амінокислотні заміни (G₁₁₉S, та Q₁₅₉R) і коротший за свій природний аналог на три амінокислотні залишки.

2. Виділено та очищено рекомбінантний білок оболонки ВМЛ з бактеріального лізату у вигляді тілець включення. Чистота препарату білка оболонки була достатня для отримання поліклональних антитіл.

3. Одержано та очищено поліклональні кролячі антитіла проти рекомбінантного білка оболонки ВМЛ, які показали високий рівень специфічності і чутливості в ІФА та Вестерн-блот аналізі.

4. Виявлено здатність рекомбінантного білка оболонки ВМЛ до стабільної димеризації в умовах in vitro.

5. Показано негативний вплив мутації Q₁₅₉R на формування гомодимерів білка оболонки ВМЛ в дріжджовій двогібридній системі.

6. За допомогою дріжджової тригібридної системи вперше показано, що білок оболонки ВМЛ з високою спорідненістю зв’язується з плюс-ланцюгом РНК4 в умовах in vivo.

7. Мутаційним аналізом встановлено, що N-термінальна частина білка оболонки ВМЛ (з 1 по 85 аз) містить РНК-зв’язувальний домен, здатний до активації експресії b-галактозидази в тригібридній системі.

Публікації автора:

1. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Аналіз гена капсидного білка вірусу мозаїки люцерни (CP AlMV), клонованого у вектор для трансформації рослин pBI121 // Мікробіологічний журнал. – 2001. – Т.63, №4. – С.62 – 68.

2. Melnychuk M.D., Spyrydonov V.G. Obtaining and purification recombinant coat protein of alfalfa mosaic virus expressed in Escherichia coli // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченко (Біологія). – 2001, Вип. 35. – С.58 – 62.

3. Спиридонов В.Г., Мельничук М.Д. РНК-связывающая активность белка оболочки вируса мозаики люцерны в трехгибридной системе Saccharomyces cerevisiae // Доп. НАН України. – 2003. – №7. – С.181 – 188.

4. Melnychuk M.D., Spyrydonov V.G. Obtaining and purification recombinant coat protein of alfalfa mosaic virus expressed in Escherichia coli // 1^st Ukrainian–Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology. – Lessidren (Bulgaria). – 2001. – P.17.

5. Melnychuk М.D., Smyrnova S.A., Spyrydonov V.G. Obtaining a rabbit polyclonal antiserum reactive against a recombinant coat protein of alfalfa mosaic virus expressed in E. coli // International symposium “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”. – Yalta (Ukraine). – 2002. – P.19.

6. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Біонебезпека трансгенних технологій з використанням 35S промотору // Наукова конференція “Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми” (Інститут цукрових буряків УААН). – Київ. – 2003. – С.83-87.