Анотація до роботи:

Петросьянц А.П. Розробка біотехнології виробництва гідролітичного ферментного препарату з a-галактозидазною активністю.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20. – біотехнологія. – Одеська національна академія харчових технологій, Одеса, 2003.

Дисертацію присвячено розробці виробництва гідролітичного ферментного препарату з a-галактозидазною активністю.

Основними задачами роботи було: вивчення різних методів виділення, очищення, концентрування і сушіння ферментного препарату; визначення впливу різних фізико-хімічних показників на активність ферменту; ідентифікація функціонально каталітичних груп активного центра ферменту; механізм дії ферменту, дослідження процесу гідролізу соєпродуктів із використанням отриманого ферментного препарату; розробка принципово технологічної схеми виробництва гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х та її промислова апробація.

Вивчено динаміку росту культури Bіfіdobacterіum longum на різних живильних середовищах та обрано оптимальне живильне середовище для подальшого культивування даної культури. Оптимальними за накопиченням біомаси були визнані середовище MRS і соєва сироватка.

Вивчено вплив природи трьох органічних розчинників (ацетону, етанолу, ізопропанолу) та їх концентрації на процес виділення a-галактозидази з культуральної рідини.

Експериментально доведено можливість застосування ультрафільтрації для концентрування й очищення культуральної рідини, що містить культуру B.longum.

Отриманий внаслідок осадження етанолом осад ферменту піддавали висушіванню. Для стабілізації активності ферменту використовували MnCl₂..

Досліджували вплив температури і рН та рН-стабільності на каталітичну активність a-D-галактозидази. a-D-галактозидаза, продукована B.longum, проявляла активність у діапазоні значень pН від 5,0 до 7,5, сягаючи максимуму при pН, близькому 6,0.

Температурний інтервал для прояву максимальної a-D-галактозидазної активності ферменту досить широкий – від 33 до 48 С, але при більш високій температурі настає його інактивація.

Одержані експериментальні дані про вплив температур на активність ферменту свідчать про досить високу термічну стійкість -галактозидази досліджуваного штаму біфідобактерій. Значна інактивація спостерігається лише при температурі 60 С і вище.

Проведено ідентифікацію каталітично функціональних груп активного центра a-галактозидази. Показано, що в каталітичному центрі a-галактозидази наявні дві функціональні групи – карбоксильна та імідазольна, що утворюють систему карбоксилат-імідазолій, яка функціонує по типу кислотно-основного каталізу. Запропоновано механізм розриву a-1,6-глікозидного зв’язку в галактоолігосахариді рафінозі.

Досліджено умови гідролізу соєвих галактоолігосахаридів. Показано, що повний їх гідроліз -галактозидазою B.longum можна досягти за 30-40 хв. ферментолізу при активності 9-10 од/мг, при рН 6,0 і температурі 45 С.

Досліджено й обґрунтовано за допомогою методів математичного моделювання оптимальні технологічні параметри процесу ферментування соєпродуктів. На підставі отриманих даних розроблено й апробовано у виробничих умовах принципово технологічну схему виробництва гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х.

1. Дисертаційну роботу присвячено розробці біотехнології виробництва гідролітичного ферментного препарату з -галактозидазною активністю. Результатом роботи є розробка нормативної документації і впровадження технології виробництва ферментного препарату Галактолонгін Г10х.

2. Вивчено динаміку росту культури Bіfіdobacterіum longum на різних живильних середовищах і обрано оптимальне живильне середовище для подальшого культивування даної культури. Було виявлено, що оптимальними за накопиченням біомаси є середовище MRS. Показана можливість використання в поживному середовищі соєвої сироватки.

Обрано оптимальні параметри дезінтеграцї клітинної стінки культури B.longum: тривалість 10 хв.; синхронізація і чутливість 9 од.

3. Проведено очищення ферменту за допомогою різних методів: осадження етанолом, гельфільтрацією, електрофорезом. Обрано робочі параметри ультрафільтрації: P = 1 атм, t = 40 С. Експериментально доведено можливість застосування ультрафільтрації для концентрування та очищення культуральної рідини, що містить культуру B.longum. Для здійснення цього процесу можна рекомендувати напівволоконні мембрани ВПУ-1500 у складі розділових модулів АР або їм подібні.

4. Вивчено вплив різних фізико-хімічних чинників на активність a-галактозидази. -галактозидаза з B.longum проявляє максимальну активність при T= 33-48 С та рН 6,0. Фермент є стабільним у діапазоні рН 6,0.

5. Проведено ідентифікацію каталітично функціональних груп активного центра a-галактозидази. Показано, що в каталітичному центрі a-галактозидази наявні дві функціональні групи – карбоксильна й імідазольна, що утворюють систему карбоксилат-імідазолій, яка функціонує за типом кислотно-основного каталізу. Запропоновано механізм розриву a-1,6-глікозидного зв’язку в галактоолігосахариді рафінозі.

6. Досліджено умови гідролізу соєвих галактоолігосахаридів. Показано, що повного їх гідролізу -галактозидазою B.longum можна досягти за 30–40 хв. ферментолізу при активності 9–10 од/мг, при рН 6,0 і температурі 45 С.

7. Досліджено і обґрунтовано за допомогою методів математичного моделювання оптимальні технологічні параметри процесу ферментування соєпродуктів, що становлять: активність ферменту 8,5 од/мг білка, тривалість – 40-50 хв. Кінетичні параметри ферментативного гідролізу для різних субстратів показали високу субстратну специфічність до стахіози K_м=26,70 мМ, V_м=47600 мМ/хв і рафінози K_м=34,92 мМ, V_м=42300 мМ/хв.

Методами ТСХ и ВЕЖХ показано, що кінцевим продуктом гідролізу галактоолігосахаридів є галактоза.

8. Розроблено принципову технологічну схему виробництва гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х, яку апробовано на підприємстві з виробництва поліпшувачів борошна на основі ферментних композицій СП «ПП Карат». На ферментний препарат розроблено нормативно-технічну документацію. Наукову новизну дослідження захищено патентом.

Розрахована собівартість отриманого ферментного препарату складає 83,36 грн/кг у цінах 2003 року.

Основний зміст роботи викладено у публікаціях

1. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П., Паулина Я.Б. Характеристика -галактозидазы бифидобактерий. // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2002, № 11. – С. 44-46.

Вивчено динаміку росту культури Bifidobacterium longum на різних живильних середовищах і обрано оптимальне живильне середовище для подальшого культивування даної культури. Обрано оптимальні параметри дезінтеграції клітинної стінки культури B.longum. Вивчено вплив різних фізико-хімічних чинників на активність -галактозидази.

2. Павленкова П.П., Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. Использование соевого обогатителя «Самсон» в производстве мясных рубленых изделий. // Наукові праці Одеської державної академії харчових технологій. – Одеса: ОДАХТ, 2002. – Вип. 23. – С. 137-142.

Вивчено функціональні характеристики та можливість використання соєвого білкового збагачувача «Самсон» у виробництві м’ясних рублених виробів.

3. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. Ферментативный гидролиз соевых галактоолигосахаридов. // Наукові праці Одеської державної академії харчових технологій. – Одеса: ОДАХТ, 2002. – Вип. 24. – С. 122-125.

Досліджено умови гідролізу соєвих галактоолігосахаридів. Розроблено науково обґрунтовану принципово технологічну схему одержання гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х.

4. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. Отримування і використання ферментного препарату галактолонгін Г-10х при переробці соєпродуктов. // Зернові продукти і комбікорми. – 2003, № 1. – С. 23-26.

Проведено очищення ферменту за допомогою різних методів. Експериментально доведено можливість застосування ультрафільтрації для концентрування й очищення культуральної рідини, що містить культуру B.longum.

5. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П., Розанов А.Я. Ідентифікація функціональних груп каталітичного центру -галактозидази Bіfіdobacterіum longum ЛМ-6. // Наукові праці Одеської національної академії харчових технологій. – Одеса: ОНАХТ, 2003. – Вип. 25. – С. 118-122.

Проведено ідентифікацію каталітично функціональних груп активного центра -галактозидази.

6. Пат. 54315 А Україна, МКП 12N9/00, Спосіб одержання -галактозидази / Л.В. Капрельянц, А.П.Петросьянц; № 2002076001; Заявл. 10.07.2002; Опубл. 17.02.03. Бюл. № 2.

7. Капрельянц Л.В., Силенко Г.П., Шерстобитов В.В., Петросьянц А.П. Функциональные продукты питання из сои. // Международная конференция «Функциональные продукты питания». – Тез. докл. – Кубань, 2001. – С. 109-110.

Проведено аналіз біохімічного складу основних сортів сої, районованих на півні України.

8. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. Функциональные продукты питания из сои. // Материалы четвертой международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек». – Москва, 2001. – С. 56-57.

Досліджено властивості біотехнології при переробці соєвих бобів у функціональні продукти.

9. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. Ферментативный гидролиз галактоолигосахаридов. // Материалы 1-го международного конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития». – Москва, 2002. – С. 380-381.

Експериментально доведено можливість застосування ферменту -галактозидази для гідролізу соєпродуктів.

10. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. -галактозидаза бифидобактерий. // Материалы 3-ей международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств». – Могилев, 2002. – С. 85-86.

Визначено, що культура B.longum являєтся джерелом активного ферменту -галактозидази.

11. Капрельянц Л.В., Петросьянц А.П. Виділення, очищення і використання ферментного препарату з -галактозидазною активністю. // Матеріали 69-ой наукової конференції молодих вчених, аспірантів і студентів «Розроблення, дослідження і створення продуктів функціонального харчування, обладнання та нових технологій для харчової і переробної промисловості». – Київ, 2003. – С. 70.

Експериментально доведено можливість застосування різних методів очищення ферменту -галактозидази. Обрано робочі параметри ультрафільтрації.