Анотація до роботи:

Синицин В.А. РОЗРОБКА І ВИГОТОВЛЕННЯ ДІАГНОСТИКУМІВ ДЛЯ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ПРИ КЛАСИЧНІЙ ЧУМІ СВИНЕЙ, ХВОРОБІ АУЄСКІ, ТЕШЕНА, БЕШИСІ, ЛЕЙКОЗІ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ, ТРИХІНЕ- ЛЬОЗІ СВИНЕЙ ТА ПРАКТИЧНЕ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ (ТЕОРЕТИЧНЕ ОБГРУН- ТУВАННЯ, ВПРОВАДЖЕННЯ ) . - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2003.

У дисертації викладено результати досліджень з розробки та науково-експериментального обгрунтування технології виготовлення діагностикумів класичної чуми свиней, ентеровірусного енцефаломієліту (хвороба Тешена), хвороби Ауєскі, лейкозу великої рогатої худоби, бешихи та трихінельозу свиней, визначення діагностичної цінності методу ІФА при лабораторних дослідженнях патологічного матеріалу від хворих тварин.

Для одержання очищених і концентрованих вірусних препаратів для ІФА розроблена високотехнологічна методика адсорбційної та гель-хроматографії на макропористих сорбентах.

Розроблена нормативно-технічна документація щодо виготовлення і контролю якості наборів для ІФА, яка затверджена в установленому порядку.

Налагоджено виробництво наборів діагностикумів, які впроваджені в роботу діагностичних лабораторій ветеринарної медицини. Забезпечено потреби держави в наборах діагностикумів.

1. Проведено теоретичне та експериментальне обгрунтування необхідності розробки нових, більш досконалих методів експресної лабораторної діагностики найбільш поширених і небезпечних інфекційних та інвазійних захворювань свиней та великої рогатої худоби ( КЧС, Тешена, Ауєскі, бешиха, трихінельоз, лейкоз) на основі імуноферментного аналізу

(ІФА).

Розроблено основні прийоми технологічних процесів з виготовлення компонентів діагностичних тест- систем.

Проведено моніторинг діагностичних досліджень цих хвороб в Україні та запропоновано шляхи забезпечення потреб лабораторій ветмедицини вітчизняними наборами для діагностики.

Розроблено та затверджено нормативні документи на виготовлення вітчизняних наборів діагностикумів для ІФА, організовано їх виробництво і забезпечено потреби в них державних лабораторій ветмедицини, отримано 3 патенти Украіни на винаходи.

2. Розроблено високотехнологічний метод очищення та концентрування вірусів КЧС, хвороби Ауєскі, Тешена, лейкозу великої рогатої худоби за допомогою адсорбційної та гель-хроматографії на макропористих сорбентах, що дозволяє одержати високоочищені антигенні препарати, придатні для постановки імуноферментного аналізу, виготовлено специфічні активні імунні сироватки, імунопероксидазні кон'югати.

Вивчено вплив різних фізико-хімічних факторів на ефективність хроматографічного очищення вірусів на макропористих сорбентах, визначено оптимальні параметри сорбентів, швидкість елюції, розмір гранул сорбентів, об’єм вірусної проби, висоту хроматографічних колонок, іонну силу та pH буферних розчинів.

3. Для серологічної діагностики хвороб Тешена, Ауєскі та лейкозу великої рогатої худоби розроблено високочутливий та специфічний метод імуноферментного аналізу, експериментально обгрунтовано його переваги в порівнянні з реакціями імунодифузії та нейтралізації, визначено діагностичні титри ( Тешена - 1:200, Ауєскі - 1:50, лейкоз - 1:100 ) та встановлено наявність високого (0,974) коефіцієнту позитивної кореляції між логариф- мами зворотних величин титрів антитіл в ІФА та РН.

4. Розроблений нами метод твердофазного імуноферментного аналізу більш простий за методикою виконання, доступний для проведення досліджень в умовах обласних ( районних ) лабораторій ветмедицини та у 30 разів більш чутливий у порівнянні з реакцією нейтралізації у культурі клітин. Визначено оптимальні параметри проведення досліджень за ІФА, розроблено модельні панелі позитивних та негативних сироваток для ІФА.

5. При дослідженні проб патматеріалу з різних органів свиней, які загинули від класичної чуми методом ІФА встановлено, що найбільша концентрація віруса знаходиться в легенях та селезінці.

Встановлена висока позитивна кореляція між результатами досліджень, що одержані в ІФА та МФА.При дослідженні 372 проб патматеріалу з 56 господарств, позитивних в ІФА, виявлено 192 (51,6%) проби, в мазках-відбитках - 181 (48,6%) та 93 (25,0%) проби у МФА з інокуляцією у культурі клітин ПК-15.

6. Розроблена методика та шкала оцінки в реакції ІФА, контролю напруги поствакцинального імунітету при КЧС за показниками титрів антитіл ( 0,0 – відсутня, 1:4 – 1:8 - слабкої напруги, 1:16 і більше - імунітет достатньої напруги), яка забезпечує активний контроль за рівнем імунітету в стаді щеплених тварин.

7. Розроблено новий спосіб виготовлення антигену збудника бешихи свиней та методику постановки реакції ІФА для визначення наявності антитіл проти нього. Встановлено наявність кореляції між показниками проби росту (ПР) та ІФА. Титр антитіл у розведенні 1:10 за ПР відповідає титру в ІФА – 1:32; 1:20 –1:64; 1:40 – 1:128; 1:80 – 1:256 і так далі.

8. Порівняльним дослідженням напруги поствакцинальних імунітетів у свиней, щеплених різними вакцинами проти бешихи ( депонована, КГОА, ВР-2) встановлено, що найвищі титри антитіл в сироватці крові тварин

( 1:1024 ) формуються після щеплення депонованою вакциною.

При контрольному зараженні вірулентним штамом збудника бешихи серед тварин, щеплених депонованою вакциною, вижили всі ( 100% захист).

9. Розроблено і впроваджено у ветеринарну практику метод імуноферментного аналізу для прижиттєвої діагностики захворювання свиней трихінельозом.

Визначено оптимальні параметри постановки реакції: мінімальні діагностичні титри антитіл, режим сенсибілізації трихінельозних антигенів на мікропланшетах, рН інкубаційного буферного розчину, температурний режим, тривалість досліджень та облік результатів ферментативної реакції.

10. Експериментально обгрунтована перевага екскреторно-секреторних антигенів для прижиттєвої діагностики трихінельозу у свиней методом ІФА у порівнянні з соматичними антигенами з трихінел.

Міжвідомчі комісійні випробування показали високу чутливість та специфічність ( 96-98 %) розробленого нами методу раннього виявлення ще слабко інвазованих свиней ( 1- 2 личинки у 25-50 дослідних зрізах м’язів).

11. Запропонований нами метод ІФА прижиттєвої діагностики трихіне- льозу придатний для виявлення специфічних антитіл проти трихінел у спонтанно заражених людей груп ризику та дозволяє своєчасно організувати їх лікування.

12. При візуальному та інструментальному методах обліку реакції імуноферментного аналізу за діагностики КЧС, хвороби Ауєскі, Тешена, лейкозу великої рогатої худоби, трихінельозу, бешихи свиней, результати цілком співпадають.

Порівняльна характеристика сорбційних властивостей мікропланшет для ІФА різних фірм: Linbro (США), Nunc (Данія), Sarstech (Німеччина), Dunetech (Швеція), Titertex (Англія), ВНІІМТ та Медполімер (Росія)показала, що найкращі результати в імуноферментному аналізі одержані на полістиролових мікропланшетах фірми Sarstesh ( Німеччина ).

13. Вперше в Україні розроблена, теоретично і експериментально обгрунтована технологія виготовлення та застосування наборів діагностикумів для імуноферментного аналізу, які використовуються в Центральній та обласних лабораторіях ветеринарної медицини України та СНД, що дозволяє значно підвищити методичний рівень і достовірність лабораторних діагностичних досліджень.

14. У результаті проведення міжвідомчих та виробничих випробувань при дослідженні патологічного матеріалу від хворих тварин встановлено, що компоненти наборів діагностикумів для імуноферментного аналізу є стандартизованими, активними та специфічними.

Розроблена нормативно-технічна документація на виробництво та застосування тест-систем для ІФА, затверджена Головним управлінням ветеринарної медицини МСГіП України.

Публікації автора:

1. Синицин В.А. Перспективи розвитку імуноферментного методу діаг- ностики інфекційних хвороб тварин // Ветеринарна медицина України. -1996. -N2. - С.18-19.

2. Синицин В.А. Серологічний контроль ефективності профілактики кла- сичної чуми свиней // Тваринництво України. -1996. -N2.- С.17.

3. Синицин В.А. Діагностика ензоотичного енцефаломієліту сви- ней (хвороба Тешена) методом імуноферментного аналізу // Ветеринарна медицина України. -1997. -N9. - С.38-39.

4. Синицин В.А. Прижиттєва діагностика трихінельозу // Ветеринарна

медицина України. -1997. -N4. - С.16.

5. Синицин В.А. Використання методу імуноферментного аналізу при

бешисі свиней // Ветеринарна медицина України. -1997. -N6. -С.38-39.

6. Синицин В. А. Діагностика класичної чуми свиней методом імунофер- ментного аналізу// Ветеринарна медицина України. -1999. -N1. - С.14-15.

7. Синицин В.А. Екологічне значення трихінельозної інвазії // Наук. вісн.Нац.

аграр. ун-ту. –К., 2001. – Вип. 42. – С.183-186.

8. Синицин В.А. Імуноферментний метод у ветеринарній медицині //Наук. вісн. Нац. аграр. ун-ту.-К., 2001. – Вип. 36. – С.123-126.

9. Синицин В.А. Динаміка титрів антитіл в імуноферментному аналізі за експериментального трихінельозу // Наук. вісн. Нац. аграр. ун-ту. – К., 2002. – Вип. 55. – С.147-149.

10. Синицин В.А. Імунологічний моніторинг у профілактиці та ліквідації класичної чуми свиней // Наук. вісн. Нац. аграр. ун-ту.- К.,2002.–Вип.58.–С.126-128.

11. Синицин В.А. Діагностична цінність методу імуноферментного ана- лізу для прижиттєвої діагностики трихінельозу // Наукові Праці Полтавської державної академії. –Полтава, 2002. Т. 2, №21. - С. 248-250.

12. Синицин В.А. Динаміка розвитку Trichinella spiralis у білих щурів та використання трихінельозних антигенів в імуноферментному аналізі // Вісник Сумського держ. аграр. університету. – Суми, 2002. - Вип. 7. – С.84-87.

13. Синицин В.А. Оптимізація непрямого імуноферментного аналізу для виявлення антитіл до Trichinella spiralis // Наук. вісн. Львівської Держ. акад. вет. медицини. –Львів, 2002. –Т. 4, №2. – Ч. 1. – С.140-144.

14. Синицин В.А. Вивчення сорбційних властивостей мікропланшет для

імуноферментного аналізу при діагностиці трихінельозу свиней //Ветеринарна біотехнологія. –Київ: Аграрна наука, 2002. – №2. – С. 223-225.

15. Синицин В.А. Виготовлення імунопероксидазних кон’югатів при ви-

робництві наборів діагностикумів трихінельозу для імуноферментного аналізу// Вісник Білоцерківського Державного аграрного університету.–Біла Церква, 2002. – Вип. 23. – С.164-168.

16. Синицин В.А. Ефективність антигенів в реакції імуноферментного аналізу при трихінельозі свиней // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб.– Харків, 2002. –Вип.80. – С.537-540.

17. Синицин В.А. Розробка тест- системи ІФА для виявлення специфічних антитіл до збудника бешихи свиней //Наук.-техн.бюл.Ін-ту біології тварин.-Львів, 2002.-Вип.4(1).- С.125-126.

18. Синицин В.А. Вплив різних фізико-хімічних факторів на хроматогра- фічне очищення біополімерів для імуноферментного аналізу на макро- пористих сорбентах //Наук.вісн.Нац.аграр.ун-ту.–К.,2003–Вип.63.- С.11-15.

19. Синицин В.А. Розробка технологічних процесів виготовлення діагнос- тичних сироваток для імуноферментного аналізу //Наук.вісн. Львівської Держ. акад. вет. медицини.- Львів, 2003.- Т.5, №2.-Ч.3.- С. 150-154.

20. Синицин В.А. Використання методу імуноферментного аналізу при діагностиці лейкозу великої рогатої худоби // Ветеринарна біотехнологія.-Київ: Аграрна наука, 2003.- №3.- С. 121-125.

21. Синицин В.А. Зажиттєва діагностика трихінельозу методом імунофер- ментного аналізу //Вісник аграрної науки. –К.,2002р.- №10. –С. 42-43.

22. Синицин В. А. Набір діагностикумів для прижиттєвого виявлення трихінельозу у тварин та людей методом імуноферментного аналізу // Ветеринарна медицина України. -1999. -N3. - С.36.

23. Синицин В.А. Технологія виготовлення діагностикумів для імунофер-

ментного аналізу та застосування їх у лабораторних дослідженнях // Наук. вісн.Нац.аграр.унів., - К., 1999. -Вип.13. -С.189-193.

24. Синицин В.А. Метод імуноферментного аналізу для діагностики кла- сичної чуми свиней // Вісник Білоцерківського Державного аграрного університету. -Біла Церква. -1998. -Вип.7. -Ч.1 -С.85-88.

25. Синицин В.А. Сучасний стан та перспективи застосування імунофер- ментного методу діагностики хвороб тварин // Вісник Білоцерківського Державного аграрного університету. -Біла Церква. -1999. -Вип.8. -С.216-221.

26. Синицин В.А. Імуноферментний аналіз в лабораторній діагностиці хвороб свиней //Вісник аграрної науки, -К., -1999. -N5. -С.34-35.

27. Синицин В.А. Прижиттєва діагностика трихінельозу методом імуно- ферментного аналізу//Наук.вісн.Нац.аграр.ун-ту.–К.,-1999.-Вип.13.-С.194-196.

28. Синицин В.А. Застосування методу імуноферментного аналізу для виявлення специфічних антитіл до вірусу ензоотичного енцефаломієліту свиней // Вісник Білоцерківського Державного аграрного університету. -Біла Церква, 1999. -Вип.8. -С.213-216.

29. Артеменко Ю.Г.,Синицин В.А., Дербаль М.Ю. Проблема трихіне- льозу в Україні // Ветеринарна медицина України.-1997.-N2.-С.24-26.

Дисертанту належить основна частина результатів з розробки методу імуноферментного аналізу для прижиттєвої діагностики трихінельозу та проведення лабораторних досліджень сироваток крові від свиней, налагодження виробництва та впровадження наборів діагностикумів у практичну лабораторну роботу Центральної та обласних лабораторій ветеринарної медицини

30. Прискока В.А., Синицин В.А. Розробка методу очищення та кон- центрування вірусів для ІФА з використанням адсорбційної та гель-хрома-

тографії // Вісник Сумського Державного аграрного університету. – Суми,1999. -Вип.4. -С.34-35.

Дисертант розробив основні параметри проведення очищення та концентрування вірусів КЧС, хвороби Тешена, за допомогою адсорбційної та гель-хроматографії на макропористих сорбентах, та тест-системи ІФА на базі очищених антигенних діагностикумів.

31. Синицин В.А.,Артеменко Ю.Г. Метод імуноферментного аналізу для прижиттєвої діагностики трихінельозу // Вісник Білоцерківського Держав- ного аграрного університету. -Біла Церква, 1999. -Вип.8. -С.221-224.

Дисертант виділив личинки трихінел у інвазованих свиней, провів порівняльну характеристику трихінельозних антигенів у реакції ІФА, розробив діагнос- тичні набори та провів їх міжвідомчі комісійні та виробничі випробування.

32. Одержання високоочищеного і концентрованого вірусу хвороби Ауєскі / Б.М. Ярчук, Л.М. Корнієнко, Л.Є. Корнієнко, М.В. Симоненко, В.О. Міщенко, І.П. Карпова, В.С. Білоконь, В.А. Синицин //Вет.медицина: Міжвід.тематич.наук.зб. -К., 1995. -Вип.70.-с.16-19.

Дисертант розробив технологію адсорбційної та гель-хроматографічної очистки та концентрування вірусу хвороби Ауєскі на макропористих кремнеземвміщуючих сорбентах. Провів аналіз очищеного антигенного препарату в реакції ІФА.

33. Проблеми трихінельозу в Україні / Ю.Г. Артеменко, Л.П. Артеменко, В.М. Горжеев, В.Ф. Титаренко, В.А. Синицин // Вісник аграрної науки. –К.,1999.-N6.-С.38-41.

Дисертант особисто розробив технологію виготовлення трихінельозного антигену для ІФА, методику одержання личинок трихінел від інвазованих тварин, відпрацював параметри ІФА, розробив нормативно-технічну документацію на набір діагностикумів трихінельозу для ІФА.

34. Патент на винахід 2002097226 Україна, 7А61К39/00. Тест-система на основі імуноферментного аналізу для прижиттєвої діагностики трихінельозу свиней. // В.А.Синицин (Україна)/ ІВМУААН.- №55269 А; Заявл.05.09.2002; Опубл.17.03.2003; Бюл.№3.

35. Патент на винахід 2002097658Україна, 7А61К39/00. Експрес-спосіб імуноферментного аналізу для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові до вірусу ензоотичного енцефаломієліту свиней (хвороби Тешена).// В.А.Синицин (Україна)/ ІВМ УААН.-№55272; Заявл.25.09.2002; Опубл.17. 03.2003; Бюл.№3.

36. Патент на винахід 2002108127Україна,7А61К39/00. Спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби методом імуноферментного аналізу.// Синицин В.А., Нагаєва Л.Г. (Україна) / ІВМ УААН.-№55284;Заявл.14.10.2002; Опубл.17.03.2003; Бюл.№3.

37. Priskoka V.A., Avalosjeva I.K., Synycyn V.A. The use of immynofermentive analisis for antigen determition in classical swine fever (CSF) vaccines // Proc. Third ESVV Symposium on pestivirus Infection, Netherlands, Lelystad. -1996. -P.112.

38. Синицин В.А. Прижиттєва діагностика трихінельозу // Агро-Світ України. –К.,1999. -N4. -С.24.

39. Синицин В.А. Лабораторна експресна діагностика //Ветеринарна газета-N18. -С.16-22.

40. Синицин В.А. Діагностика класичної чуми свиней методом імуноферментного аналізу // Сільські обрії. -1995. -N1-2. -С.38-39.

41. Синицин В.А., Прискока В.А., Собко А.І. Набір вітчизняних препаратів для експресної діагностики класичної чуми свиней //Аграрна наука - виробництву. –К., УААН. -1998. -N3. -С.20.

42. Набір вітчизняних препаратів для діагностики хвороби Тешена у свиней / В.А. Синицин, В.А. Прискока, А.І. Собко, А.П. Старчеус //Аграрна наука - виробництву. -К.: УААН, 1999. -N1. - С.22.

43. Розробка методу імуноферментного аналізу для контролю напруги імунітету при вакцинації свиней проти класичної чуми свиней, хвороби Ауєскі та бешихи / В.А. Синицин, А.І. Собко, В.А. Прискока, М.Г. Оста- пець, Є.В. Резуненко, В.І. Кирилов, Л.А. Пантелейчук, О.Я.Трясоруб //Тез.доп. наук.-практ.конф. "Збереженість молодняка с.-г. тварин - запорука розвитку тваринництва України" .- Харків,1994. -С.45-46.

44. Метод імуноферментного аналізу для оцінки накопичування вірусного антигену при виробництві вакцин проти КЧС /А.І. Собко, В.А. Прискока, В.А. Синицин, В.І. Кирилов, О.П. Адаменко // Тез.доп. наук.-практ.конф. "Збереженість молодняка с.-г. тварин - запорука розвитку тваринництва України".- Харків,1994.-С.60-61.

45. Метод імуноферментного аналізу для діагностики класичної чуми свиней / А.І. Собко, В.А. Прискока, В.А. Синицин, В.І. Кирилов // Тез.доп. наук.-практ.конф. "Збереженість молодняка с.-г. тварин - запорука розвитку тваринництва України".- Харків,1994.-С.61-62.

46. Синицин В.А. Диагностика классической чумы свиней методом иммуноферментного анализа // Общая эпизоотология: иммунологические, эко- логические и методологические проблемы: Матер.Междунар.науч.конф. –Харьков,1995. -С.263-266.

47. Синицин В.А., Собко Ю.А., Панченко О.О. Использование набора диагностикумов энзоотического энцефаломиелита свиней (болезнь Тешена) для иммуноферментного анализа при эпизоотических обследованиях // Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблеммы: Матер.Междунар.науч.конф. –Харьков,1995.-С.253-255.

48. Сравнительная характеристика напряженности гуморального иммунитета у свиней вакцинированных разными вакцинами против рожи свиней / В.А. Синицин, А.Ф. Ображей, Н.Г. Остапец, А.Я. Трясоруб // Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблеммы: Матер.Междунар.науч.конф. – Харьков,1995.-С.534-536.

49. Синицин В.А. Диагностика классической чумы свиней методом иммуноферментного анализа // Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики: Матер науч.-практ. конф. ВИИИВВиМ. –Покров,1995. -С.75.

50. Результаты изучения напряженности иммунитета при классической чуме свиней в хозяйствах Украины с помощью метода иммуноферментного анализа / В.И. Кирилов, А.И. Собко, М.П. Голик, В.А. Синицин //Класси- ческая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики: Матер. науч.-практ. конф. ВИИИВВиМ. –Покров,1995. -С.91.

51. Прижиттєва діагностика трихінельозу / В.А. Синицин, А.Ю. Сини- цин, А.Я. Трясоруб, Ю.Г. Артеменко, М.Ю. Дербаль, А.І. Москаленко, С.Д. Коломієць // Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми: Збірник матеріалів міжнародної науково-практичної конференції, 24-26 вере- сня 1997 р.–Харків,1997.-С.47.

52. До порівняльної оцінки лабораторних методів діагностики кла- сичної чуми свиней / М.Д. Патлатюк, О.Т.Шиков, Л.П. Гришок, В.А. Сини- цин, В.І.Кирилов // Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми: Збірник матеріалів міжнародної науково-практичної конференції, 24-26 вересня 1997 р. –Харків,1997. -С.8.