Анотація до роботи:

Ситник К.С. Розробка модельної системи отримання транспластомних рослин на прикладі представників родини пасльонових.– Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004.

В дисертаційній роботі запропоновано та розроблено новий підхід для здійснення пластидної трансформації. Підхід полягає в створенні за допомогою соматичної гібридизації цибридних рослин з ядром рослини, яка має високу регенераційну здатність та пластидами рослини, що цікавить, але має низьку регенераційну та трансформаційну здатність; генетичній трансформації пластид та зворотньому їх перенесенні в клітини того ж виду, до якого належать пластиди або до іншого виду, ядро якого є сумісним з даним пластомом.

На першому етапі роботи за допомогою методу обробки протопластів поліетиленгліколем векторною плазмідою з селективним геном aadA (аминоглікозид 3`- аденілінтрансфераза), оточеним гомологічними послідовностями хлДНК, виконали трансформацію хлДНК отриманих раніше цибридних рослин Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis) та Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata). Трансформовані рослини відбирали на селективному середовищі зі спектиноміцином. Другий етап полягав в перенесенні трансгенних пластид Salpiglossis sinuata з цибридної рослини до рослин Salpiglossis sinuata дикого типу. В наступній серії експериментів векторною конструкцією з селективним геном aadA та репортерним геном uidA (ген b-глюкуронідази) здійснили хлоропластну трансформацію рослин тютюну та перенесли трансгенні пластиди тютюну в рослини Lycium barbarum.

1. Запропоновано та розроблено новий підхід до здійснення пластидної трансформації. Підхід полягає в перенесенні пластид від рослини, що цікавить, до рослини-посередника (рослини з високою регенераційною здатністю), трансформації пластид та їх зворотньому перенесенні.

2. Показана можливість генетичної трансформації пластому хлоропластів, що функціонують в клітинах інших видів.

3. Вперше отримано хлоропластні трансформанти цибридних рослин Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaina оfficinalis) та Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata).

4. Отримано хлоропластні трансформанти Salpiglossis sinuata за допомогою соматичної гібридизації між транспластомними рослинами Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) та рослинами Salpiglossis sinuata дикого типу.

5. Молекулярнo-біологічний аналіз транспластомних рослин Salpiglossis sinuata показав, що вони мають ядерну та пластидну ДНК Salpiglossis sinuata, а мітохондріон успадкували від Nicotiana tabacum та Salpiglossis sinuata.

6. Отримано трансформанти Nicotiana tabacum з селективним геном aadA та репортерним геном uidA, що експресуються в хлоропластах.

7. Показана можливість отримання гібридної рослини в результаті соматичної гібридизації транспластомної рослини Nicotiana tabacum з генами uidA та aadA, вбудованими в хлоропластний геном та рослини Lycium barbarum дикого типу. На селективному середовищі була відібрана одна зелена колонія, з якої було отримано п’ять регенерантів. Листові тканини рослин-регенерантів експресують ген uidA.

8. Молекулярно-біологічний аналіз колонії, отриманої в результаті соматичної гібридизації транспластомної рослини Nicotiana tabacum та рослини Lycium barbarum дикого типу, показав, що хлоропластний геном колонія отримала від Nicotiana tabacum, ген aadA присутній в пластомі, а в ядерній ДНК не виявлено генетичного матеріалу Nicotiana tabacum. Отже, показано, що ядро Lycium barbarum та пластом Nicotiana tabacum можуть спільно функціонувати.