Анотація до роботи:

Гільчук П. В. Розробка технології одержання одноланцюгових антитіл в Escherichia coli. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено розробці технології одержання одноланцюгових антитіл (ScFv – single-chain Fv) в Escherichia. coli. Методом фагового дисплея з імунної комбінаторної бібліотеки кДНК V-генів миші ізольовано ДНК специфічних до рекомбінантного IFN-a2b людини ScFv. Секреторною експресією в E. coli синтезовано цільовий білок. Розроблено метод очищення ScFv, показано високу специфічність взаємодії їх з IFN-a2b і унікальність первинної структури доменів V_H і V_L. Встановлено, що експресія з промотору Т7 і внутрішньоклітинне накопичення ScFv забезпечують значно вищий їхній вихід в E. coli (~500 мг/л) порівняно із секреторною експресією (~2 мг/л). На основі ДНК ScFv і целюлозо-зв’язувального домену (CBD) сконструйовано ген гібридного білка ScFv-CBD та здійснено його експресію в E. coli. Білок очищено, виділено у функціонально активному стані та іммобілізовано методом біоафінного зв’язування з целюлозним носієм. З використанням одержаного імуносорбенту розроблено спосіб хроматографічного очищення рекомбінантного IFN-a2b людини з освітленого лізату клітин-продуцентів з високим ступенем чистоти (~95 %).

У результаті виконання дисертаційної роботи розроблено комплексну лабораторну технологію одержання специфічних одноланцюгових антитіл миші експресією в Escherichia coli та запропоновано спосіб їхнього застосування для очищення цільових білків.

1. Методом фагового дисплея отримано ДНК, яка кодує специфічні до рекомбінантного IFN-a2b людини ScFv, і проведено її секвенування.

2. Одержано та охарактеризовано бактеріальний продуцент, який забезпечує секреторну експресію ScFv проти IFN-a2b людини і їхнє накопичення в біологічно активному стані.

3. Продемонстровано унікальність первинної структури обох варіабельних доменів і високу специфічність взаємодії з IFN-a2b для виділених ScFv.

4. Створено бактеріальні надпродуценти ScFv у разі застосування для експресії системи транскрипції бактеріофага Т7 і стратегії внутрішньоклітинного накопичення цільового продукту. Для отриманих продуцентів досягнуто значно вищого виходу ScFv порівняно із секреторною експресією.

5. Розроблено лабораторний метод одержання ScFv у біологічно активному стані та очищення їх із клітин-продуцентів.

6. Сконструйовано рекомбінантні плазміди і одержано бактеріальні продуценти гібридного білка ScFv-CBD. Іммобілізацією ScFv-CBD на целюлозі створено афінний імуносорбент для одностадійного хроматографічного очищення рекомбінантного IFN-a2b людини із освітленого лізату клітин E. coli з високим ступенем чистоти (>95 %).

7. Вперше показано створення хроматографічних сорбентів нового типу за принципом орієнтованої іммобілізації ScFv на целюлозному носії через білок-партнер.

Публікації автора:

1. Окунев О. В., Гильчук П. В., Иродов Д. М. Дерябина Е. Г. Получение и характеристика одноцепочечных антител к интерферону 2b человека // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 5. - С. 106-115. Особистий внесок здобувача – автором проведено афінну селекцію і скринування комбінаторної бібліотеки кДНК V-генів миші, ізольовано ДНК, що кодує специфічні до IFN-a2b людини ScFv, проведено експресію ScFv в E. coli штаму НВ2151, охарактеризовано цільовий білок та бактеріальний продуцент.

2. Гільчук П. В, Окунєв О. В., Іродов Д. М., Павлова М. В. Суперпродукція одноланцюгових антитіл до a2b інтерферону людини в Escherichia coli і виділення їх у біологічно активній формі // Укр. біохім. журн. – 2006. – Т.78, №1. - С. 163-171. Особистий внесок здобувача – автором розроблено генетичну конструкцію для продукції ScFv у Т7 системі експресії, здійснено експресію ScFv в E. coli BL21(DE3), охарактеризовано продуцент, проведено хроматографічне очищення ScFv, розроблено лабораторний метод ренатурації ScFv із тілець включення, підтверджено наявність біологічної активності у ренатурованого білка.

3. Гільчук П. В., Окунєв О. В., Павлова М. В., Іродов Д. М., Горбатюк О. Б. Одержання злитого білка ScFv-CBD і його застосування для афінного очищення рекомбінантного інтерферону a2b людини // Укр. біохім. журн. – 2006. - Т. 78, № 2. - С. 18-27. Особистий внесок здобувача – автором запропоновано використати CBD із целюлосоми Clostridium thermocellum як білок-партнер для орієнтованої іммобілізації ScFv на носії, розроблено генетичні конструкції для продукції гібридного білка ScFv-CBD в E. coli штаму BL21(DE3), проведено експресію цільових генів, охарактеризовано одержані продуценти, проведено кількісне порівняння ефективності різних методів ренатурації ScFv-CBD із тілець включення, показано створення на основі біологічно іммобілізованих молекул ScFv афінного імуносорбенту.

4. Гільчук П. В., Окунєв О. В., Іродов Д. М., Павлова М. В., Яковенко О. Я. Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону a2b людини // Біополімери і клітина. - 2006. – Т. 22, № 2. - C. 157 – 161. Особистий внесок здобувача – автором розроблено лабораторний спосіб одержання афінного імуносорбенту у разі орієнтованої і нековалентної іммобілізації ScFv на целюлозному носії. З використанням створеного сорбенту і автоматизованого хроматографічного обладнання розроблено спосіб одностадійного виділення рекомбінантного IFNa2b людини із освітленого лізату клітин-продуцентів з високим ступенем чистоти.

5. Gilchuk P.V., Volkov G.L. Immobilization of mouse single chain antibodies for affinity chromatography using cellulose-binding protein // Укр. біохім. журн. – 2006. - Т. 78, № 4. - С. 156-159. Особистий внесок здобувача – автором досліджено зв’язування білка ScFv-CBD з різними типами целюлозних носіїв, підібрано оптимальний носій для іммобілізації. Приведено схему лабораторного способу одержання афінного імуносорбенту і його використання для хроматографічного очищення цільових білків.

6. Гильчук П. В. Оценка методов ренатурации для промышленного получения рекомбинантных белков из телец включения Escherichia coli в биологически активной форме // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20, № 3. - C. 182-192. Особистий внесок здобувача – в огляді автором проаналізовано сучасні методи, які використовуються для промислового одержання рекомбінантних білків із тілець включення E. coli. Наведено дані власних досліджень стосовно ренатурації ScFv проти IFN-a2b людини.

7. Гильчук П., Окунєв О., Дерябина Е. Клонирование и некоторые особенности синтеза ScFv-фрагмента иммуноглобулина мыши к 2b-интерферону человека в разных экспрессионных системах E. coli // Междунар. конф. «Новые технологии получения и применения биологически активных веществ». - Алушта (Украина), 2002. - C. 102-103. Особистий внесок здобувача – автором охарактеризовано клітини E. coli, які забезпечують секреторну експресію ScFv. Показано накопичення ScFv клітинами у тільцях включення у разі використання для експресії системи транскрипції фага Т7.

8. Gilchuk P. V., Okunev O. B., Irodov D. M., Deryabina O. G., Kordyum V. A. Expression of the recombinant antibodies to human interferon 2b // Abstract book of conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. - Kyiv (Ukraine), 2003. – P. 149. Особистий внесок здобувача – автором проаналізовано збагачення імунної комбінаторної бібліотеки кДНК V-генів миші у кожному з трьох послідовних циклів афінної селекції фагової бібліотеки на іммобілізованому IFN-a2b. Проведено фінгерпринт-аналіз для виявлення гетерогенності за нуклеотидним складом серед ізольованої ScFv-ДНК різних клонів.

9. Гільчук П. В., Окунєв О. В., Дерябіна О. Г., Кордюм В. А. Рекомбінантні антитіла до інтерферону 2b людини // Конференція молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології»: Тези доповідей (Київ, Інститут біохімії імені О. В. Палладіна, 2003) Укр. біохім. журн. – 2003. – Т. 75, № 5. – С. 125. Особистий внесок здобувача – автором продемонстровано специфічність взаємодії ScFv з IFN-a2b людини. Проведено секвенування кодуючої частини цільового гена, проаналізовано первинну структуру V-доменів ScFv, показано абсолютну унікальність ділянки CDRH3.

10. Gilchuk P., Okunev O., Yakovenko A., Irodov D. Obtaining of single chain antibodies to certain epitope of human interferon 2b molecule and evaluation of their binding capacity // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Abstract book. – Lviv (Ukraine), 2004. - P. 292. Особистий внесок здобувача – автором досліджено застосування селективних умов елюції рекомбінантних фагів при афінному збагаченні фагової бібліотеки для виділення ScFv проти цільових епітопів IFN-a2b.