Анотація до роботи:

Піотрович В. А. Розробка живильних середовищ для культивування культур клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16. 00. 03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний аграрний університет, Київ, 2002.

Дисертація присвячена питанню культивування культур клітин. При виготовленні живильних середовищ за білкову основу запропоновано використовувати ферментативний гідролізат білків крові великої рогатої худоби із відходів виробництва сироватки. Експериментальним шляхом знайдені оптимальні умови проведення гідролізу. Отримано 21 серію гідролізатів, які характеризувалися такими хімічними показниками: вміст амінного азоту – 805±13,7 мг/100см³; вміст триптофану – 120,5±4,9 мг/100см³; концентрація водневих іонів – 6,86±0,05. Визначено переносну нетоксичну концентрацію гемогідролізату у складі живильних середовищ, яка становила 5-7,5 %. Доведена можливість використання живильного середовища гемогідролізат для культивування первинних і перещеплюваних культур клітин. Клітини, вирощені на живильних середовищах з гідролізатом білків крові, використані з позитивними результатами для репродукції вірусу хвороби Тешена. Удосконалена методика отримання сироватки крові та запропоновані прості і надійні методи її контролю. Отримано лінію клітин тестикулів поросят-гнотобіотів із стабільними морфофункціональними якостями та високим індексом проліферації. Культура ПТП адаптована до середовища гемогідролізат. При застосуванні культури ПТП для репродукції вірусу хвороби Тешена отримані високі титри інфекційності.

1. Розроблено та запропоновано для практики культуральне живильне середовище – ферментативний гідролізат білків крові (ФГБК) великої рогатої худоби. Середовище виготовлене із вітчизняних компонентів, дешеве, просте у приготуванні, призначене для культивування первинних і перещеплюваних культур клітин та вірусів різного походження.

2. Визначені оптимальні умови проведення ферментативного гідролізу білків крові великої рогатої худоби: розбавлення субстрату розчином Хенкса у співвідношенні 1:2; концентрація ферментативного препарату – 35-45%, трипсину 4-5 г/дм³ кров’яної маси; температура гідролізу 38-42єС; початкове значення рН суміші, яка гідролізується 7,4 – 7,8; тривалість гідролізу – 2-3 доби.

3. Рідкий ФГБК – прозора рідина від солом’яно-жовтого до жовто-коричневого кольору різної інтенсивності, зі вмістом амінного азоту 710-949 мг/100см³, триптофану 120,5±4,9 мг/100см³, величиною рН 6,86±0,5 та з характерним без гнильного запахом.

4. Живильні середовища на основі 5- і 7,5%-го ФГБК, при культивуванні первинних та перещеплюваних культур клітин, забезпечують накопичення біомаси життєздатних клітин і продуктивний їх ріст. За морфологічною характеристикою моношару, строками формування та індексом проліферації клітин препарат не поступається ГЛА та синтетичному живильному середовищі 199.

5. Встановлена придатність клітин, вирощених із застосуванням живильних середовищ на основі ФГБК, забезпечувати репродукцію вірусу хвороби Тешена. Титр інфекційності вірусу складає на різних культурах 10^-7,0 –10^-8,24 ТЦД ₅₀/см³, що не відрізняється від цього показника при використанні клітин, вирощених на інших середовищах. Середовища на основі ФГБК, поряд із імпортними препаратами на основі чистих амінокислот і гідролізатів білків, використовуються як підтримуючі при репродукції вірусу хвороби Тешена.

6. Сироватка крові великої рогатої худоби нативна без консерванту, одержана за простою методикою, із застосуванням контрольної системи, забезпечує повноцінний ріст та розвиток клітин у культурі.

7. Отримана стабільна за морфофункціональними якостями лінія перещеплюваних клітин тестикулів поросят із високим індексом проліферації (1:8-1:12). Культура адаптована до вітчизняного живильного середовища і забезпечує високі титри інфекційності різних вірусів свинячого походження.

Пропозиції виробництву

При масовому вирощуванні клітин у культурі, в разі самостійного виготовлення живильних середовищ та розчинів, пропонуємо використовувати технологію безвідходного виробництва, яка забезпечує використання рідкої частини крові для отримання сироватки, а згустків крові – для приготування основ живильних середовищ, призначених для культивування культур клітин.

На основі результатів дослідних та виробничих випробувань партій ФГБК та сироватки крові нативної без консерванту розроблена і затверджена нормативна документація на їх виробництво і застосування.

Культуру клітин ПТП, одержану із тестикулів поросят-гнотобіотів, доцільно використовувати для вірусологічних досліджень – постановки реакції нейтралізації, титрування інфекційності вірусів по ЦПД, напрацювання біомаси вірусів з метою приготування вакцинних та діагностичних препаратів.

Публікації автора:

1. Піотрович В. А. Ферментативний гідролізат білків крові великої рогатої худоби як основа живильних середовищ для культур клітин // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту: Зб. наук. праць. – Біла Церква, 1999. – Вип.9. – С. 129-133.

2. Піотрович В. А. Біологічний контроль гемогідролізату – живильного середовища для культур клітин // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Біла Церква, 2000. – Вип. 14. – С. 225-229.

3. Піотрович В. А. Гідролізні середовища – основа успішного використання методу культур клітин // Матер. Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених: “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” – Київ, 2000.- С. 44-47.

4. Піотрович В. А. Альтернативне живильне середовище для культур тваринних клітин при вирощуванні вірусу Encephalomyelitis enzootica suum // Вісник аграрної науки. – Київ, 2001. - № 10. – С. 76-77.

5. Пат. 40865 А Україна, МПК⁷ С 12 N 5/00, Лінія перещеплюваних клітин тестикулів поросят для вірусологічних досліджень / А. М. Жуковський, О-й О. Кучерявенко, В. А. Піотрович; Інститут ветеринарної медицини УААН. - № 2000084920; Заявлено 18.08.00; Опубл. 15.08.01, Бюл. № 7.

Дисертантом проведено адаптацію культури ПТП до живильного середовища гемогідролізату та доведено можливість використання культури для культивування вірусу хвороби Тешена.