Анотація до роботи:

Гарагуля Г. I. СЕРОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ ПЕРЕПЕЛІВ ЩОДО ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ ПРИ ВИГОТОВЛЕННІ ТА ВИКОРИСТАННІ КУЛЬТУР КЛІТИН. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія.

Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків, 2004.

Дисертація присвячена вивченню інфікованості вірусами перепелів та можливості використання інкубаційного яйця для одержання ембріонів і виготовлення з них первинних культур клітин для культивування вірусів різних родин. Проведено серологічний моніторинг вірозів перепелів 16 ферм 8 регіонів України і встановлена пряма кореляція між серопозитивністю та вірусоносійством. Показано, що інфікованість вірусами-збудниками хвороб ряду курячих залежить від умов утримання і контакту з поголів’ям інших видів птиці. При ізольованому утриманні перепелів титри противірусних антитіл в їх сироватці коливались від 0 до 2 log₂ та відсутнє вірусоносійство, що дозволяє вважати їх благополучними. Інкубаційне яйце з цих господарств можна використовувати для інкубації та виготовлення з ембріонів первинних культур клітин. В разі утримання перепелів з іншими видами птиці можливе їх інфікування вірусами, що підтверджується високими титрами противірусних антитіл (від 3 до 9 log₂) та виділенням вірусу ньюкаслської хвороби від перепелів одного з господарств. Це свідчить про непридатність інкубаційного яйця перепелів цих господарств для використання з біотехнологічною метою. Випробувано методи одержання первинних культур фібробластів перепелиних ембріонів і встановлено, що переваги має модифікована методика, при якій у 7-9-добових ембріонів видалялась тільки голова. Клітини, що отримані із тканин ембріонів, були морфологічно однорідними та мали високу проліферативну активність. Оптимальна посівна концентрація клітин при ролерному методі культивування становить 200-300 тисяч клітин в 1 см³, а при стаціонарному – 500-700 тисяч. Моношар за таких умов формується у найкоротший термін – за 24-48 годин. Ролерний метод культивування дозволяє отримати з одного ембріона в 1,8 рази більшу кінцеву концентрацію клітин із розрахунку на одиницю об’єму живильного середовища у порівнянні з матрасами. З’ясовано можливість застосування первинних культур фібробластів перепелиних ембріонів для культивування вакцинних і польових штамів вірусів птиці і ссавців. Штами вірусів викликали характерну для кожного цитопатогенну дію через 24-72 годин після інфікування.

1. За результатами серологічного моніторингу перепелів 16 птахогосподарств 8 регіонів України у 1998-2003 роках виявлена серопозитивність щодо збудників вірусних інфекцій птиці на 12 фермах, встановлена кореляція рівня специфічних антитіл і вірусоносійства, що є критерієм оцінки благополуччя птахогосподарств і можливості постачання інкубаційного яйця для отримання ембріонів і виготовлення з них первинних культур клітин. Випробувано метод одержання і культивування фібробластів ембріонів перепелів, визначена їх чутливість до вірусів різних родин.

2. В птахогосподарствах України, де виявлена серопозитивність перепелів, нестабільність епізоотичної ситуації з інфекційних хвороб обумовлена недодержанням вимог протиепізоотичних заходів та ізольованого утримання перепелів від інших птахів. Найвища інфікованість перепелів збудниками хвороб Марека, інфекційного бронхіту, інфекційного ларинготрахеїту, адено- та реовірусної інфекції реєструється на фермах Дніпропетровської, Сумської та Полтавської областей і Автономної Республіки Крим, в яких титри вірусоспецифічних антитіл досягають 4-8 log₂.

3. Високий рівень вірусоспецифічних антитіл корелює з вірусоносійством. Титри специфічних антитіл від 3 log₂ і вище свідчать про вірусоносійство, що підтверджується виділенням збудника ньюкаслської хвороби на ембріонах і первинних культурах клітин. У перепелів з невисокими титрами специфічних антитіл (1-2 log₂) віруси не виділені.

4. Для виготовлення первинної культури клітин придатні 7-9-добові ембріони перепелів, які за морфологічними показниками онтогенетичного розвитку відповідають 10-11-добовим ембріонам курей. Використання трьох ембріонів перепелів забезпечує вихід такої ж кількості клітин, як із одного ембріона курей (30-35 мільйонів клітин) і достатнє для висіву у два 1,5-літрових матраси при стаціонарному або два 3-літрових бутля при ролерному культивуванні.

5. Посівна концентрація клітин із ембріонів перепелів 200-300 і 400-500 тисяч на 1 см³ живильного середовища забезпечує формування за 18-24 години суцільного моношару при ролерному (у флаконах та бутлях) і стаціонарному (у матрасах і пробірках) культивуванні, відповідно. Зменшення посівної концентрації збільшує термін формування моношару клітин. До 20-25% висіяних клітин не прикріплюються до поверхні скла, а застосування способу “зливів клітин” у 2-3 рази підвищує ефективність використання трипсинізованої тканини ембріонів перепелів.

6. Первинна культура клітин, що виготовлена з тканин ембріонів перепелів 7-9-добової інкубації, складається з веретеноподібних клітин з короткими цитоплазматичними відростками, з округлими ядрами, розміщеними в центрі клітин, і за морфологічними ознаками не відрізняється від культури фібробластів ембріонів курей. Термін життєздатності культури клітин при одноразовій заміні середовища становить 10-12 діб.

7. Перепелині ембріони чутливі до вірусів хвороб птиці (ньюкаслської, інфекційного бронхіту, інфекційного ларинготрахеїту) та хвороби Ауєскі. При культивуванні збудників хвороби Ауєскі, інфекційного бронхіту та ларинготрахеїту у ембріонів спостерігають відставання у рості та розвитку і крововиливи на шкірі. Інфікування вірусом ньюкаслської хвороби викликає загибель ембріонів та накопичення його в екстраембріональній рідині у титрі до 6,56 lg ЕЛД₅₀, що нижче, ніж на культурі фібробластів перепелів, на 0,67-1,77lg.

8. Культура фібробластів перепелів чутлива до вірусів - збудників хвороб птиці (Марека, ньюкаслської, герпесвірусу індиків та авіреовірусу) та ссавців (міксоматозу кролів та хвороби Ауєскі), репродукція яких відбувається з появою характерних цитопатичних змін, забезпечує накопичення біомаси з титром інфекційної активності на третьому пасажі вірусу хвороби Ауєскі – 5,8 lg ТЦД₅₀/см³ , міксоматозу – 4,4 lg ТЦД_50//см³ , ньюкаслської хвороби - 8,77 lg ЕЛД₅₀/см³.