Анотація до роботи:

Клочко В.В. Штам-продуцент антистафілококового антибіотика батуміну і його біосинтетична активність. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченю штама "Pseudomonas batumici" – продуцента антистафілококового антибіотика батуміну, таксономічним дослідженням продуценту, особливостям біосинтезу батуміну, його виділенню і очищенню, а також характеристиці антимікробної активності антибіотика за сучасними стандартами CLSI.

Таксономічне дослідження штаму-продуценту батуміну "Pseudomonas batumici" методом поліфазного аналізу з використанням сіквенсу 16S рРНК показало його еволюційну близькість (99%) до п'яти видів псевдомонад: P. gingeri, P. asplenii, P. fuscovaginae, P. oryzihabitans та P.putida. В той же час "P. batumici" істотно відрізнявся від них за своїми фенотиповими властивостями, що свідчить про його видову самостійність.

Оптимізовано поживне середовище та встановлено умови культивування "P.batumici": температура - 25С; рН»7,0; коефіцієнт аерації 0,6-0,9 г О₂/лгод. Проведено вирощування продуцента в умовах ферментера (вихід батуміну становив 170-180 мг/л).

Розроблені два методи визначення концентрації батуміну в культуральній рідині і в очищених препаратах антибіотика – біологічний (метод дифузії в агар) та фізіко-хімічний (спектрофотометричний) . Кожен з цих методів може використовуватися в залежності від поставлених завдань.

Розроблена схема препаративного виділення і очистки батуміну. Після стадії двоступеневого хроматографічного очищення екстракту культуральної рідини ступінь очищення антибіотика становив 85-90%.

Висока активність та селективність дії батуміну щодо стафілококів була перевірена і підтверджена згідно міжнародних сучасних стандартів CLSI.

1. Таксономічне дослідження штаму-продуценту батуміну "Pseudomonas batumici" методом поліфазного аналізу з використанням сіквенсу 16S рРНК показало його еволюційну близькість (99%) до п'яти видів псевдомонад: P. gingeri, P. asplenii, P. fuscovaginae, P. oryzihabitans та P.putida. В той же час "P. batumici" істотно відрізнявся від них за своїми фенотиповими властивостями, що свідчить про його видову самостійність.

2. Встановлено оптимальні умови культивування "P. batumici" та біосинтезу батуміну: температура - 25С; рН»7,0; коефіцієнт аерації 0,6-0,9 гО₂/лгод. Розроблено оптимізоване за вмістом макро- і мікроелементів поживне середовище, яке містить глюкозу як джерело вуглецю і сечовину як джерело азоту у співвідношенні С/N=10:1. Показана стимулююча біосинтез дія ряду органічних кислот (піровиноградної, н-масляної, стеаринової) і амінокислот (ізолейцин, метионін).

3. Вихід батуміну в умовах періодичного процесу культивування "P.batumici" в ферментері становив 170-180 мг/л і залежав від кількості посівного матеріалу і інтенсивності аерації. Синтез антибіотика проходив паралельно з ростом культури і досягав максимуму через 50-55 год культивування.

4. Біологічний (метод дифузії в агар) та фізико-хімічний (спектрофотометричний) методи визначення батуміну давали однакові результати при встановленні його концентрації в розчинах очищеного препарату, але в 1,5-2 рази відрізнялися при дослідженні вмісту батуміну в культуральній рідині продуцента. В останньому випадку надійні результати давав фізико-хімічний метод визначення батуміну.

5. Удосконалено метод препаративного виділення батуміну. Двоступенева колонкова хроматографія (стаціонарна фаза – силікагель, елюент – система ацетон:бензол (1:1) забезпечувала 85-90%-ну очистку препарату. Останній характеризувався типовими для батуміну фізико-хімічними показниками ( l_max в УФ-спектрі – 225 нм, оптичний кут обертання [a]_d²⁵ = -13,5; хімічні зсуви протонів при ЯМР-аналізі – 0,8-1,4; 1,8-2,6; 3,2-3,4; 4,0-4,2; 4,7-4,9; 5,5-6,4; 7,2-7,4 м.д) та спектром біологічної дії.

6. Вперше проведено дослідження біологічної активності батуміну згідно міжнародних стандартів CLSI. Підтверджено унікальність селективної дії батуміну на різні види стафілококів (мінімальна інгібуюча концентрація становила 0,25-0,5 мкг/мл). Більшість грампозитивних, в тому числі анаеробних, та грамнегативних бактерій, грибів та дріжджів виявилися стійкими до дії антибіотика.

Публікації автора:

1. Клочко В.В., Кіпріанова О.А., Смірнов В.В. Вплив умов культивування на антибіотичну активність “Pseudomonas batumici”-продуцента батуміну // Мікробіол.журнал, 2004. – т.66, №1. – С.42-48. (Здобувачем були самостійно встановлені параметри культивування продуцента батуміну: досліджено вплив різних режимів температури, рН, аерації, вивчено ріст культури в періодичному процесі та встановлено його зв'язок з біосинтезом батуміну).

2. Клочко В.В. Роль джерел мінерального живлення в процесі біосинтезу антистафілококового антибіотика батуміну // Науковий вісник Чернівецького університету. Сер. біологія. – 2004. – № 194. – С. 17-22.

3. Клочко В.В., Кіпріанова О.А. Фізико-хімічний та мікробіологічний методи визначення антистафілококового антибіотика батуміну // Науковий вісник Чернівецького університету. Сер. біологія. – 2006. – № 297. – С. 62-66. (Здобувачем розроблено біологічний і фізико-хімічний методи визначення концентрації батуміну як в очищених препаратах, так і в культуральній рідині продуцента згідно рекомендацій Фармакопеї України; проведена порівняльна оцінка цих методів між собою).

4. Клочко В.В., Кіпріанова О.А. Біосинтез і антимікробний спектр антибіотика батуміну // Міжнар. наук. конф. "Мікробні біотехнології". – Одеса (Україна), 2006. – С. 132.

5. Киприанова Е.А., Чуркина Л.Н., Клочко В.В. Приходько В.А.. Оригинальный отечественный антибиотик батумин: структура и активность, биотехнология, перспективы использования в медицине // Матеріали VI Національного з’їзду фармацевтів України "Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України". – Харків, 2005. – С. 346-347.

6. Клочко В.В., Желобецька О.В. Дослідження впливу різних джерел живлення на синтез антистафілококового антибіотика батуміна // Міжнар. наук.-практ. конференція "Шевченківська весна". – Київ (Україна), 2004. – С.30-32.

7. Клочко В.В. Влияние некоторых источников питания на биосинтез антибиотика батумина // Междунар. научно-практ. конф. "Биология – наука XXI века". – Пущино (Россия), 2004. – С.263-264.

8. Чуркіна Л.М., Клочко В.В. Деякі особливості дії батуміну на біосинтетичну активність власного штаму-продуцента // Х з’їзд Товариства мікробіологів України. – Одеса (Україна), 2004. – С.93.

9. Клочко В.В., Киприанова Е.А., Смирнов В.В. Оптимальные параметры культивирования штамма “Pseudomonas batumici” – продуцента антистафилококкового антибиотика батумина // Междунар. научно-практ. конф. "Биология – наука XXI века". – Пущино (Россия), 2003. – С.106-107.