Анотація до роботи:

Смуток О.В. Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L-лактат:цитохром c-оксидоредуктази Hansenula polymorpha. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Дисертаційна робота присвячена скринінгу дріжджових продуцентів стабільної форми L-лактат:цитохром c-оксидоредуктази (флавоцитохрому b₂), його виділенню, фізико-хімічній і ензимологічній характеристиці та біоаналітичному використанню у харчовій технології.

Прведено скринінг 14 видів та штамів дріжджів і відібрано H. polymorpha 356 як перспективний продуцент стабільного флавоцитохрому b₂. Оптимізовано умови культивування дріжджів з максимальним виходом ферменту.

Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату флавоцитохрому b₂ з клітин перспективного продуцента стабільного ферменту - метилотрофних дріжджів H. polymorpha. Досліджено деякі фізико-хімічні та ензимологічні характеристики ферменту.

На основі високоочищеного препарату флавоцитохрому b₂ H. polymorpha і осмійвмісного полімерного медіатора розроблено лабораторний прототип амперометричного біосенсора, вивчено його аналітичні характеристики та показана придатність для визначення L-лактату у винах.

Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату. Метод ґрунтується на ензиматичному окисленні L-лактату до пірувату в присутності фериціаніду з одночасним відновленням нітротетразолієвого синього до кольорового реагенту – формазану. Метод було використано для кількісного визначення L-лактату у зразках вин.

У результаті експериментальних досліджень проведено скринінг дріжджових продуцентів флавоцитохрому b₂, виділено та охарактеризовано фермент із клітин найперспективнішого продуцента, встановлено деякі його фізико-хімічні властивості, створено нові ензиматичні та біосенсорні аналітичні підходи визначення L-лактату з використанням цього ферменту.

Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Розроблено новий метод виявлення активності флавоцитохрому b₂ на електрофореграмах, який ґрунтується на взаємодії фероціаніду, що утворюється в ході L-лактат-залежної ензиматичної реакції, з йонами заліза (III) з утворенням інтенсивно забарвленої нерозчинної Берлінської блакиті.

2. Проведено скринінг низки видів та штамів дріжджів за здатністю до синтезу стабільного флавоцитохрому b₂, відібрано кращий продуцент ферменту – Hansenula роlymorpha 356.

3. Показано, що метилотрофні дріжджі H. роlymorpha, нездатні до росту на лактаті як єдиному джерелі вуглецю та енергії, мають високий рівень активності флавоцитохрому b₂ (до 0,7 мкмольхв^-1 на 1 мг білку безклітинного екстракту). Синтез фермента мало залежить від природи вуглецевого субстрату (глюкоза, етанол, гліцерол), проте індукується L-лактатом і підвищенням інтенсивності аерації. При вирощуванні H. роlymorpha у середовищі з глюкозою та лактатом спостерігається діауксія, причому, лактат засвоюється після вичерпання глюкози.

4. Оптимізовано умови культивування клітин H. роlymorpha - продуцента флавоцитохрому b₂, розроблено просту та ефективну схему очистки цільового ферменту. Показано, що фермент із H. роlymorpha володіє підвищеною термостабільністю у порівнянні з аналогічним білком пекарських дріжджів. Отримано очищений препарат флавоцитохрому b₂ з питомою активністю

12 мкмольхв^-1мг^-1 білка, придатний для біоаналітичних цілей.

5. Проведено дослідження деяких фізико-хімічних властивостей флавоцитохрому b₂: молекулярної маси субодиниці (60 кДа), спектрів поглинання та його термостабільності.

6. На основі термостабільного флавоцитохрому b₂ H. роlymorpha сконструйовано амперометричні біосенсори для кількісного визначення L-лактату. Завдяки використанню двоетапної схеми електроосадження ферменту і опосередкування електронного перенесення через осмій-вмісний редокс-полімер, біосенсори характеризуються високою селективністю та чутливістю до L-лактату, хорошою операційною стабільністю.

7. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату з використанням флавоцитохрому b₂ H. polymorpha. Проведено скринінг електронних медіаторів та хромогенних систем, оптимізовано умови протікання реакції та визначено діапазон лінійності методу (0,02 - 0,15 мM L-лактату).

8. Запропоновані аналітичні методи на основі флавоцитохрому b₂ апробовано на реальних зразках вин. Порівняльний аналіз різних підходів визначення L-лактату виявив високий рівень кореляції між ензиматичним та біосенсорним методами (R = 0,99).

Публікації автора:

1. Гайда Г.3., Стельмащук С.Я., Смуток О.В., Гончар М.В. Новый метод обнаружения ферментативной активности флавоцитохрома b₂ на электрофореграммах // Прикл. биохим. и микробиол. – 2003. – Т. 39, № 2. - С. 249-252. (Дисертант брав участь у розробці методу та проводив деякі електрофоретичні дослідження).

2. Smutok O., Gayda G., Gonchar M., Schuhmann W. A novel L-lactate-selective biosensor based on the use of flavocytochrome b₂ from methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Biosens. Bioelectron. – 2005. - V. 20. – P. 1285-1290. (Дисертант розробив та дослідив основні характеристики L-лактат селективного біосенсора на основі флавоцитохрому b₂).

3. Смуток О.В., Осьмак Г.С., Гайда Г.З., Гончар М.В. Скрининг дрожжей – продуцентов стабильной формы L-лактат-цитохром с-оксидоредуктазы и исследование регуляции ее синтеза // Микробиология. – 2006. – Т. 75, № 1. – С. 29-34. (Дисертант провів скринінг низки дріжджів за здатністю підвищеної стабільності флавоцитохрому b₂ та дослідив регуляцію синтезу ферменту).

4. Smutok O., Ngounou B., Pavlishko H., Gayda G., Gonchar M., Schuhmann W. A reagentless bienzyme amperometric biosensor based alcohol oxidase/peroxidase and an Os-complex modified electrodeposition paint // Sensors and Actuators B. – 2006. – 113, N 2. – P. 590-598. (Дисертант розробив оптимальну архітектуру біосенсора із використанням осмій-вмісних електроосаджуваних полімерів та дослідив основні його характеристики).

5. Смуток О.В., Гайда Г.З., Шуман В., Гончар М.В. Розробка L-лактат-селективного біосенсора на основі термостабільної L-лактат -цитохром c-оксидоредуктази дріжджів // У книзі: „Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій” (за ред. акад. Г.В. Єльської, акад. В.Д. Походенка). - К.: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, 2006. – С. 51-57. (Дисертант розробив та охарактеризував різні типи біосенсорів на основі флавоцитохрому b₂ – із використанням як вільнопроникаючих, так і електроосаджуваних медіаторів. Провів апробацію біосенсора на реальних зразках вин).

6. Гайда Г.З., Стельмащук С.Я., Смуток О.В., Павлішко Г.М., Гончар М.В. Виділення, очистка та біоаналітичне використання L-лактат:цитохром с-оксидоредуктази (флавоцитохрому b₂) із термотолерантних дріжджів Hansenula polymorpha // Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду – Чернівці (Україна). - Укр. біохім. журн. – 2002. - Т. 74, № 4б (додаток 2) - С. 154.

7. Павлішко Г.М., Смуток О.В., Гайда Г.З., Гончар М.В. Нові оксидазні методи аналізу етанолу, метанолу, формальдегіду та лактату // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції "БІОХІМІЯ” – Дніпропетровськ (Україна). – 2003. – С. 37-39.

8. Гончар М.В, Гайда Г.З., Павлишко Г.Н., Смуток О.В., Демкив О.М., Чореги Е., Шуман В. Микробные оксидо-редуктазы: генетическое конструирование продуцентов, выделение, очистка и биоаналитическое применение ферментов // Тезисы Всероссийского симпозиума «Микробная биотехнология» - Москва (Россия). – 2004. – С. 21.

9. Гончар М.В, Гайда Г.З., Павлішко Г.М., Смуток О.В., Демків О.М., Шлеєв С.В., Ярополов А.І., Чорегі Е., Шуман В. Виділення, очистка, характеристика та біоаналітичне використання оксидоредуктаз мікробного походження // Тези доповідей Х з‘їзду товариства мікробіологів України – Одеса (Україна). – Астропринит - 2004. - С. 21.

10. Ковальчук Є.П., Остапович Б.Б., Турик З.Л., Ковалишин Я.С., Павлішко Г.М., Смуток О.В. Амперометричні біосенсори на основі електропровідних полімерів // ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція „Біотехнологія. Освіта. Наука”. Збірник тез доповідей - Львів (Україна). – Львів: Вид-во Нац. ун-ту „Львівська Політехніка” - 2004. – С. 56.

11. Смуток О.В., Павлішко Г.М., Демків О.М., Закальська О.М., Гайда Г.З., Гончар М.В. Нові ензиматичні та біосенсорні методи контролю вмісту етанолу, лактату та гліцеролу в алкогольних напоях // ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція „Біотехнологія. Освіта. Наука”. Збірник тез доповідей - Львів (Україна). – Львів: Вид-во Нац. ун-ту „Львівська Політехніка” - 2004. – С. 125.

12. Осьмак Г.С., Смуток О.В., Гончар М.В. Скринінг дріжджів - продуцентів стабільних форм флавоцитохрому b₂ // Молодь і поступ біології. І Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів. Збірник тез – Львів (Україна). – 2005. – С. 124-125.

13. Смуток О.В., Павлішко Г.М., Рябова О.Б., Гайда Г.З., Гончар М.В., Сибірний А.А. Вивчення біоаналітичних характеристик лабораторної моделі біосенсора на основі флавоцитохрому b₂. Отримання мутантів дріжджів Hansenula polymorpha зі зниженою спорідненістю алкогольоксидази до етанолу і виділення мутантної форми ферменту // Конференція-звіт з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України „Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”. Збірник тез доповідей - Київ (Україна). – 2005. – С. 70.

14. Осьмак Г.С., Смуток О.В., Гайда Г.З., Гончар М.В. Виділення, очистка флавоцитохрому b₂ та розробка нового спектрофотометричного методу визначення L-лактату на його основі // Матеріали IX Українського біохімічного з’їзду – Харків (Україна) – 2006. – Т. 2. – С. 213.

15. Осьмак Г.С., Смуток О.В., Гайда Г.З., Гончар М.В. Скринінг дріжджів - продуцентів стабільної форми флавоцитохрому b₂ його виділення, очистка та біоаналітичне використання // Тези доповідей міжнародної наукової конференції „Мікробні біотехнології” - Одеса (Україна). – 2006. - С. 19.

16. Осьмак Г.С., Смуток О.В., Гончар М.В. Розробка нового спектрофотометричного методу визначення L-лактату на основі флавоцитохрому b₂ // Молодь і поступ біології. ІІ Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів. Збірник тез – Львів (Україна). – 2006. – С. 66-67.

17. Sibirny V., Maidan M., Pavlishko H., Stasyk O., Smutok O., Stel'mashchuk S., Gonchar M., Sibirny A. Bioanalytical application of enzymes from methylotrophic yeasts // Abs. 21st Intern. Special. Symp. On Yeasts (ISSY 2001) "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts" – Lviv (Ukraine). – 2001. - P. 84.

18. Gayda G.Z., Smutok O.V., Pavlishko H.M., Gonchar M.V. Regulation of synthesis, isolation and bioanalytical application of L-lactate cytochrome c oxidoreductase (flavocytochrome b₂) from thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // Abs. 4^th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” - Wroclaw (Poland). – 2002. - P. 84.

19. Gonchar M.V., Smutok O.V., Gayda G.Z. Flavocytochrome b₂ from thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: regulation of synthesis and isolation // Abs. FEMS Congress – Ljubljana (Slovenia). – 2003. – P. 331.

20. Smutok O., Gayda G., Schuhmann W., Gonchar M. Flavocytochrome b₂ from thermotolerant yeast Hansenula polymorpha as a biorecognizing element of L-lactate-selective biosensor // International Weigl Conference ”Microorganisms in Pathogenesis and their Drug Resistance” – Lviv (Ukraine). – 2003. - P. 95.

21. Smutok O.V., Gayda G.Z., Gonchar M.V., Schuhmann W. Development of a novel L-lactate-selective biosensor based on the use of flavocytochrome b₂ from methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics – Kyiv (Ukraine). – 2003. - P. 216.

22. Smutok O.V., Gayda G.Z., Gonchar M.V., Schuhmann W. Flavocytochrome b₂ from thermotolerant yeast Hansenula polymorpha as a recognition element of L-lactate-selective biosensor // Materialy konferencyjne – Lodz (Polska). – 2003. - S. 236.

23. Gayda G., Pavlishko H., Smutok O., Demkiv O., Pavlyk A., Gonchar M., Sakharov I., Csregy E., Schuhmann W. Selection of microbial producers, isolation, purification and application of some enzymes of bioanalytical importance // Fіrst (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology - Lviv (Ukraine). – 2004. – P. 101.

24. Gonchar M., Gayda G., Pavlishko H., Smutok O., Sibirny V., Kotylak Z., Sibirny A. Metabolically engineered yeast cells and enzymes as the biorecognition elements of biosensors // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology – Lviv (Ukraine). – 2004. – P. 85.

25. Smutok O., Gayda G., Sydorovych I., Sadnyc’ka M., Gonchar M. Regulation of synthesis of flavocytochrome b₂ in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology - Lviv (Ukraine). – 2004. – P. 387.

26. Gonchar M., Gayda G., Smutok O., Pavlishko H., Demkiv O., Csoregy E., Schuhmann W. Application of some oxido-reductases as the biorecognition elements of amperometric biosensors // Abs. of XVIII International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics “Bioelectrochemistry-2005” - Coimbra (Portugal). - P. 124.

27. Gonchar M., Sibirny A. Gayda G., Smutok O., Pavlishko H., Demkiv O., Korpan Y., Martelet C., Jaffrezic-Renault N., Csoregy E., Schuhmann W. Oxido-reductases from genetically engineered yeast strains and their bioanalytical application // Abs. of International conference “Analytical Chemistry and Chemical Analysis 1)- Kyiv (Ukraine). – 2005 - P. 347.

28. Erichen T., Janiak S., Alpeeva I., Smutok O., Schuhmann W. On-line kontrolle von weinfermentationspozessen mittels eines automatischen analysators mit integrierten reagenzlosen biosensoren // Abs. Anwenderrteffen Weinanalytik - 2005. – P. 13.

29. Smutok O.V., Gayda G.Z., Osmak H.S., Gonchar M.V. Screening the yeast strains producing a stable form of flavocytochrome b₂ and study of regulation of its synthesis / In: 5^th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling” – Kyiv (Ukraine) // Ukr. Biochem. J. – 2005. - V. 77, N2. - P. 234.

30. Gonchar M., Smutok O., Demkiv O., Paryzhak S., Gayda G., Schuhmann W. Novel recombinant and genetically modified enzymes as the biorecognition elements of the biosensors // Abs. of Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology “Current State and Prospects for Future Cooperation” - Kyiv (Ukraine). - 2006. – P. 70.

31. Gonchar M., Smutok O., Pavlishko H., Gayda G., B. Ngounou, Schuhmann W. Bi-enzyme oxidase- and peroxidase-based amperometric biosensor for alcohol, formaldehyde and glycerol assay // Abs. of International conference “Peroxidase 2006” - Aveiro (Portugal). - P. 72.