Анотація до роботи:

_{Лужецький А.М. Система клонування генів у штамах актиноміцетів – продуцентах канаміцину Streptomyces kanamyceticus та ландоміцину Е Streptomyces globisporus 1912. – Рукопис.}

_{Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика.– Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, Київ, 2003.}

_{Розроблено ефективну методику перенесення рекомбінантних плазмід в штами – продуценти канаміцину S.kanamyceticus 1 та ландоміцину Е S.globisporus 1912 за допомогою кон’югації з E.coli. Показано, що інтегративні конюгативні плазміди pSET152 і pVWB успадковуються штамами S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 з частотою 100% під час вирощування в неселективних умовах. Реплікативні конюгативні плазміди pSOK101, pSOK201 та pCHZ101 підтримуються у 20 % клонів досліджуваних штамів після трьох пересівів у середовищі без антибіотика. Плазміда pSET152 інтегрується у два сайти (attB1 і attB2) хромосоми S.kanamyceticus 1 та S.globisporus 1912 і пригнічує біосинтез канаміцину та ландоміцину Е, досліджені реплікативні кон‘югативні плазміди не впливають на рівень продукції антибіотиків. Клоновано і секвеновано чотири ORF, що оточують attB1- і attB2- сайти для інтеграції фага jС31 в хромосомі S.kanamyceticus 1. Інтеграція pSET152 зумовлює руйнування ORF1, яка кодує білок, що, імовірно, бере участь у процесі конденсації хромосоми.}

_{Розроблено векторну систему для спрямованого мутагенезу lnd-генів у штамі S.globisporus 1912. Проведено заміщення гена lndА, який кодує b-кетоацилсинтазу на ген стійкості до канаміцину. Отриманий штам S.globisporus NKN не продукує ландоміцину Е. Експресія генів lndElndFlndAlndBlndClndD під контролем конститутивного промотора гену канаміцинстійкості aphII у продуценті спорідненого антибіотика урдаміцину А призводить до продукції нового ангуцикліна. Інтеграція плазміди pOJmellan2 в хромосому S.cyanogenus S136 призводить до полярного ефекту на гени lanGT4, lanZ3, lanZ4, lanZ5 та продукції цим штамом нових ландоміцинів F та Н, з різною кількістю цукрів у своїх молекулах і без гідроксильної групи у позиції С11 аглікону.}

_{В результаті виконаної роботи розроблено систему клонування генів у цілому ряді штамів актиноміцетів, для яких трансформація протопластів відбувається з низькою частотою. Показано ефективність використання цієї системи для отримання рекомбінантних штамів актиноміцетів шляхом спрямованого мутагенезу та гетерологічної експресії генів.}

_{1. Створена система клонування генів в продуцентах канаміцину S.kanamyceticus та ландоміцину Е S.globisporus 1912 за допомогою кон’югаційного перенесення рекомбінантних плазмід з E.coli. Показана ефективність цього підходу стосовно ще 14 видів актиноміцетів, більшість з яких трансформуються з низькою частотою. Штами E.coli, які несуть плазміди IncP групи несумісності, є найефективнішим донором у схрещуванні з актиноміцетами.}

1. _{Інтегративні конюгативні плазміди pSET152 і pVWB стабільно підтримуються в хромосомах штамів S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 під час вирощування в неселективних умовах. Ексконюганти цих штамів в неселективних умовах втрачають реплікативні конюгативні плазміди pSOK101, pSOK201 та pCHZ101 з високою частотою.}

2. _{Плазміда pSET152 інтегрується у два сайти (attB1 і attB2) хромосоми S.kanamyceticus 1 та S.globisporus 1912. Виявлено і секвеновано чотири ORF, що оточують attB1- і attB2- сайти S.kanamyceticus 1. Інтеграція pSET152 зумовлює руйнування ORF1, яка кодує білок, що, імовірно, бере участь у процесі конденсації хромосоми.}

3. _{У ексконюгантів S.kanamyceticus 1 та S.globisporus 1912, що містять плазміду pSET152, пригнічується продукція канаміцину і ландоміцину Е, відповідно. Наявність в цих штамах реплікативних плазмід pSOK101, pSOK201, pCHZ101 та інтегративної pVWB не впливає на рівень продукції антибіотиків.}

4. _{Розроблена система клонування використана для спрямованої інактивації генів S.globisporus 1912 і S.cyanogenus S136. Цим методом доведено, що клоновані lnd- та lan-кластери відповідають за синтез ландоміцинів Е та А, відповідно.}

5. _{Інтеграція плазміди pOJmellan2 в хромосому штаму S.cyanogenus S136 призводить до полярного ефекту на гени lanGT4, lanZ3, lanZ4, lanZ5. Штам S.cyanogenus S136 pOJmellan2+ продукує нові ландоміцини F та Н. Гетерологічна експресія плазміди pWPK1, яка містить гени lndABCDLFE, у штамі S.fradiae Tu2717 призводить до продукції рекомбінантним штамом нової сполуки, ідентифікованої методом ТШХ та ВЕРХ.}

Публікації автора:

_{1. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Голець Л.М., Громико O.M., Демидчук Ю.O., Кириченко Н.В., Лужецький А.М., Мазепа А.Й., Мар‘їна О.В., Самбір М.В. Конструювання штаму Streptomyces kanamyceticus – продуцента канаміцину, використовуючи методи клітинної та та генної інженерії // Вісник Харківського університету.Сер.біол. 1999. Т.3, №1, P.138.}

_{2. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Панькевич К.О., Дубицька Л.П., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології . – 2000. – №8.-С.27-31.}

_{3. Лужецький А., Мазепа А, Мар‘їна О. Використання міжродової кон‘югації Escherichia coli – Streptomyces для введення генетичної інформації в штами Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces kanamyceticus // Вісник Львівського університету. Сер.біол. 2000. №.25. С.74-80.}

_{4. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межродовая конъюгация Еscherichia coli - Streptomyces globisporus 1912 с использованием интегративной плазмиды pSET152 и ее производных // Генетика. –2001.-Т.37, №10.-С.1340-1347.}

_{5. Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Transfer of plasmids from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Науковий вісник Ужгородського національного університету, Серія Біологія. –2001.-Т.10.-С.147-149.}

_{6. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Fedorenko V. Obtaining and studying of Streptomyces galilaeus HKI 022 exconjugants, which carry conjugative plasmids pWA1, pSET152, and pWPK // Вісник Львівського університету. Сер.біол. 2001. №.27. С.89-96.}

_{7. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Мар’їна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів. Глава з монографії „Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”. K.: Логос.-2001.- Т.1. – С.469-476.}

_{8. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. A gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136. Вісник Львівського унівеситету. Сер.біол. 2002. №.29. С.62-68.}

_{9. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Braa A., Mendez C., Salas J.A., Bechthold A., Fedorenko V. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett.-2003.-V.222(1).-P.149-153.}

_{10. Pankevych K., Demydchuk J., Luzhetskiy A., Ostash B., Basiliya L., Weber K., Fedorenko V., Saluz H. and Krugel H. Pathway alignment and analysis of the landomycin E biosynthetic gene cluster from Streptomyces globisporus 1912. Dresden, VAAM-Workshop " Biologie der Actinomyceten" – Theses. – 1999.-26-28 September. -P. V18.}

_{11. Luzhetskyy A. Introducing of plasmid DNA into Streptomyces kanamyceticus, the producer of medical important antibiotic kanamycin. 2nd international medical conference for students and young doctors-April 28-30, 2000-Theses-P.:134-136. Lublin, Poland.}

_{12. Luzhetskyy A. Conjugative transfer of plasmid pSET152 from E.coli to Streptomyces kanamyceticus and Streptomyces globisporus.// Conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted to 100th anniversary of genetics: Proc. (L'viv, Ukraine, 20 -22 April 2000). – L’viv, 2000. - P. 69.}

_{13. Luzhetskyy A. M.. Development of gene cloning system in strains producers of antitumor antibiotics. // 8th International scientific conference for student and young doctors; 4-6 May 2000, Gdansk, Poland (Theses).}

_{14. Luzhetskyy A., Revonyuk N., Fedoryshyn M. Plasmid clining vectors which include genes for Landomycinb E biosinthesis. Conference on genetics and molecular biology for students and young scientifists devoted to 100 th anniversary of genetics: Proc.(L’viv, Ukraine, 20-22 April 2000). L’viv. –2000.- P. 76.}

_{15. Ostash B.O., Pankevych K.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Kruegel H., Fedorenko V.O. Studying of genes involved in landomycin E biosynthesis by Streptomyces globisporus 1912 // 12th international symposium on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Theses.-P.133.}

_{16. Fedorenko V.O., Ostash B.O., Luzhetskiy A. M., Basiliya L.I., Pankevych K.O., Gromyko O.M., Rebets Y., Kruegel H. Genetic control of antitumor antibiotic landomycin E biosynthesis in Streptomyces globisporus 1912 // Materialy ogolnopolskiego symposium mikrobiologicznego, Krakow, Poland, 6-8 Wrzesien 2001. Theses.-P.17-18.}

_{17. Luzhetskyy A., Fedorenko О., Fedoryshyn M., Revonyuk N. Conjugation between Eshcherichia coli – Streptomyces as effective way of development gene cloning system in producers of antitumor antibiotics // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstracts book. P.180.}

_{18. Luzhetskiy A.M., Ostash B.O., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Conjugative transfer of plasmid DNA into Streptomyces – producers of antitumor antibiotics //12th international symposium on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Theses.-P.80.}

_{19. Fedoryshyn M.Y., Luzhetskyy A.M. Obtaining of recombinant strains of Streptomyces galilaeus – producer of aclacinomycins. // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstracts book. P.90.}

_{20. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Bechthold A., Fedorenko V. Pathway-specific regulatory genes for landomycins E and A biosynthesis of Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136, a new member of SARP family// VAAM – Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduczenten” 29.Sept.-1 Okt.2002, Freiburg. – P.28.}

_{21. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: effects of chromosomal insertion on kanamycin production. Freiburg, VAAM-Workshop " Biologie der Actinomyceten" - 2002-29 September–1 October. V3.}

_{22. Ребець Ю., Осташ Б., Лужецький А., Хофмейстер Д., Брана А., Мендез К., Салас Х.А., Бехтольд А., Федоренко В. Гени, що контролюють біосинтез ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 135-136.}

_{23. Осташ Б., Лужецький А., Громико О., Ф Ломбо., Салас Х.А., Федоренко В. Генетичний контроль глікозилювання протипухлинного антибіотика ландоміцину Е: вивчення гену lndGT4 Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 130-131.}

_{24. Лужецький А., Лябах Н., Федоришин М., Хофмейстер Д., Бехтольд А., Федоренко В. Гетеро логічна експресія генів біосинтезу ландоміцину Е в штамі Streptomyces fradiae Tu2717 продуценті урдаміцинів // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 128-129}

_{25. Лужецький А., Грек М., Федоришин М., Осташ Б., Басілія Л., Бехтольд А., Федоренко В. Використання кон’югації для створення рекомбінантних штамів Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 127-128.}