Анотація до роботи:

Волкова К. Д. Ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції фібрилярного a-синуклеїну. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 — біотехнологія. — Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.

Мета дисертаційної роботи — пошук нових флуоресцентних зондів серед ціанінових барвників для специфічної детекції фібрил a-синуклеїну та вивчення структури комплексу барвник/амілоїдна фібрила. Уперше запропоновано ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції амілоїдних агрегатів b-лактоглобуліну і a-синуклеїну. Виявлено структурні фрагменти, наявність яких у молекулі ціанінів сприяє його зв’язуванню з фібрилярними білками. Комплекси барвник/фібрилярний a-синуклеїн охарактеризовано за допомогою методів флуоресцентної анізотропії, спектроскопії з розділенням у часі й атомної силової мікроскопії. На основі результатів комп’ютерного моделювання запропоновано модель комплексу барвник/фібрила, згідно з якою барвник розміщується в «каналі зв'язування» своєю найдовшою віссю паралельно довгій осі фібрили. Моно- (Т-284) і триметинціанінові (SH-516) барвники запропоновано як зонди для визначення a-синуклеїну, агрегованого у фібрили та кількісної оцінки процесу фібрилоутворення in vitro.

Уперше на основі ціанінових барвників розроблено нові флуоресцентні зонди для специфічної детекції амілоїдних фібрил in vitro і запропоновано модель зв’язування ціанінів із фібрилами a-синуклеїну.

1. З'ясовано, що моно- та триметинціанінові барвники у присутності фібрил b-лактоглобуліну та a-синуклеїну підвищують інтенсивність флуоресценції у 10-100 разів, тоді як додавання агрегованого у фібрили білка майже не впливало на інтенсивність емісії пента-, гептаметинціанінів і сквараїнів.

2. Показано, що наявність у гетерозалишках ціанінових барвників стирильних, амінних, метиламінних чи диметиламінних замісників і метильного заміснику в b-положенні триметинціанінів сприяє їх зв’язуванню з фібрилярними білками.

3. Про утворення комплексу ціанінів із фібрилярним a-синуклеїном свідчить зростання значень флуоресцентної анізотропії (до ~0,28) та часу життя збудженого стану (до ~2,5 нс) барвників, порівняно з ціанінами у вільному стані чи у присутності мономерного білка. Обчислено константи зв’язування барвник/фібрила a-синуклеїну (К_зв) для ціанінів Т-284 (~1,810⁶ М^-1) і SH-516 (~1,510⁶ M^-1).

4. На основі комп’ютерного моделювання запропоновано модель комплексу барвник/фібрила, згідно з якою барвник розміщується в «каналі зв'язування» своєю віссю паралельно довгій осі фібрили.

5. Обчислення розмірів молекул барвників дає змогу припустити, що для оптимальної фіксації в «каналі зв'язування» фібрили розмір барвників не повинен перевищувати 6,5 по основних осях і бути від ~3 до ~4,5 по осі Z.

6. Вперше запропоновано монометинціаніновий барвник Т-284 і триметинціанін SH-516 для кількісного визначення фібрилярного a-синуклеїну. Лінійний діапазон детекції агрегованого білка становив 1,5-19 мкг/мл (Т-284) і 1,5-28 мкг/мл (SH-516). Показано можливість практичного застосування цих барвників для флуоресцентного визначення не лише фібрилярного a-синуклеїну, а й агрегованого у фібрили інсуліну та лізоциму.

Публікації автора:

1. Cyanine dye–protein interactions: looking for fluorescent probes for amyloid structures / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, R. J. Vermeij, V. Subramaniam, Yu. L. Slominskii, S. M. Yarmoluk // J. Biochem. Biophys. Methods. 2007. Vol. 70, № 5. P. 727–733. Особистий внесок здобувача — спектральні дослідження серії моно-, три-, пента- і гептаметинціанінових барвників у присутності мономерного та фібрилярного БЛГ.

2. Specific fluorescent detection of fibrillar alpha-synuclein using mono- and trimethine cyanine dyes / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, M. Yu. Losytskyy, A. G. Golub, R. J. Vermeij, V. Subramaniam, O. I. Tolmachev, S. M. Yarmoluk // Bioorg. Med. Chem. 2008. Vol. 16, № 3. P. 1452–1459. Особистий внесок здобувача — спектральні дослідження серії ціанінових барвників у присутності АСН, обчислення константи зв’язування барвників з фібрилою.

3. Дослідження серії моно- та триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного b-лактоглобуліну / К. Д. Волкова, В. Б. Ковальська, А. О. Баланда, Ю. Л. Сломінський, О. І. Толмачов, В. Субраманіам, С. М. Ярмолюк // Ukrainica Bioorganica Acta. 2008. Т. 6, № 2. С. 15–21. Особистий внесок здобувача — спектральні дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників у присутності мономерного і фібрилярного БЛГ, виявлення хімічних груп, які сприяють зв’язуванню барвників із фібрилами.

4. Explorations of the application of cyanine dyes for quantitative a-synuclein detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, G. M. Segers-Nolten, G. Veldhuis, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Biotechnic & Histochemistry. 2009. Vol. 84, № 2. P. 55–61. Особистий внесок здобувача — дослідження можливості застосування амілоїд-чутливих барвників T-284 і SH-516 для визначення фібрилярного АСН in vitro.

5. Novel fluorescent dyes for selective fibrillar amyloidogenic proteins detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, M. Yu. Losytskyy, A. G. Golub, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“First Conference of Young Scientists of Institute of Molecular Biology and Genetics Dedicated to the 185^th Anniversary of Gregor Mendel”], (Kyiv, 17-18 May, 2007). K. : Inst. of Mol. Biol. and Gen. NASU, 2007. 155 p. Особистий внесок здобувача — аналіз залежності між здатністю барвника підвищувати флуоресценцію у присутності фібрилярних білків і його хімічною структурою.

6. Novel fluorescent dyes for selective fibrillar alpha-synuclein detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“Biological Basis of Senile Pathology Development”], (Kyiv, 29 January, 2007). K. : Inst. of Gerontology AMNU, 2007. 162 p. Особистий внесок здобувача — спектральні дослідження серії ціанінів у присутності АСН; виявлення хімічних груп, що сприяють зв’язуванню барвник/фібрила.

7. Cyanine dyes as novel fluorescent probes for selective amyloid proteins detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, R. J. Vermeij, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“First Asian Spectroscopy Conference & Asian Biospectroscopy Conference 2007”], (Bangalore, 29 January-2 February, 2007). Bangalore : Indian Inst. of Science, 2007. 540 p. Особистий внесок здобувача — спектральні дослідження серії ціанінів у присутності БЛГ; виявлення хімічних груп, що сприяють зв’язуванню барвників із фібрилами.

8. Novel fluorescent dyes for selective fibrillar a-synuclein detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, M. Yu. Losytskyy, R. J. Vermeij, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“10^th Conference on Methods and Applications of Fluorescence”], (Saltzburg, 9-12 September, 2007). Regensburg: Inst. of Anal. Chem., Chemo- and Biosensors, 2007. 498 p. Особистий внесок здобувача — спектральні дослідження серії моно- і триметинціанінів у присутності АСН; аналіз залежності між здатністю барвника підвищувати флуоресценцію у присутності фібрилярних білків та його хімічною структурою.

9. Cyanine dye T-284 interaction with a-synuclein fibril: fluorescence anisotropy studies / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“Actual problems of biochemistry and biotechnology 2008”], (Kyiv, 12-13 June, 2008). K. : , 2008. 40 p. Особистий внесок здобувача — дослідження барвника Т-284 у комплексах із амілоїдними фібрилами АСН в поляризованому світлі.

10. Studies of T-284 and SH-516 cyanine dyes as fluorescent probes for specific a-synuclein fibrils detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“Bridges in Life Sciences Annual Scientific Review”], (Zagreb, 4 October, 2008). Budapest : VARIMED Ltd., 2008. 112 p. Особистий внесок здобувача — характеризація комплексів ціанінових барвників T-284 і SH-516 із фібрилярним АСН методами флуоресцентної спектроскопії з розділенням у часі, поляризаційної флуоресцентної спектроскопії та атомної силової мікроскопії.