Анотація до роботи:

Трофімова П.С. Удосконалення лабораторних методів діагностики туберкульозу на основі сучасних уявлень про біологію його збудника. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, Харків, 2007.

Дисертацію присвячено питанням розробки нових прискорених методів індикації та ідентифікації мікобактерій туберкульозу, вивчення розповсюдження та біологічних особливостей штамів збудника туберкульозу, стійких до антимікобактеріальних препаратів.

Виявлено збільшення частоти виділення мультирезистентних M. tuberculosis по м. Києву та деяких регіонах України, вивчені їх біологічні особливості.

Впроваджено в практику модифікований метод пропорцій для постановки тесту медикаментозної стійкості M. tuberculosis як більш точного та економічного в порівнянні з методами, що існують в Україні.

На основі результатів культуральних досліджень з використанням нового агарового середовища зі стимулятором росту та ПЛР-аналізу розроблені прискорені методи індикації та ідентифікації M. tuberculosis.

В роботі вирішено актуальну наукову задачу – удосконалено існуючі методи індикації та ідентифікації збудника туберкульозу та розроблено нові прискорені методи для покращення мікробіологічної діагностики туберкульозу. Обґрунтовано мікробіологічні підходи проведення моніторингових досліджень за медикаментозною стійкістю в країні, що створює перспективи інтеграції у світову моніторингову мережу спостереження за резистентністю збудників туберкульозу.

1. За період 1990 – 2002 рр. виявлено збільшення частоти виділення медикаментозностійких штамів МБТ та появу варіантів M. tuberculosis, стійких до 6-ти і більше антимікобактеріальних препаратів, що свідчить про погіршення епідемічної ситуації з туберкульозу в країні, відображенням якої є епідемія хіміорезистентного туберкульозу в Україні. Так, якщо в 1990 р. M. tuberculosis, чутливі до антимікобактеріальних препаратів, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, то в 2002 р. їх кількість не перевищувала 24,3 % (р < 0,001), тобто за даний період часу цей показник знизився в 2,2 рази, а питома вага хіміорезистентних штамів МБТ зросла майже в 1,6 разів – з 46,5 % до 75,5 % (р < 0,05).

2. В 2003 – 2005 рр. виявлено високу розповсюдженість мультирезистентних штамів МБТ, які циркулюють серед хворих на вперше діагностований туберкульоз легень. В 2003 р. кількість таких штамів становила 13,6 %, а в 2005 р. – 16,9 %, тоді як експерти ВООЗ встановили, що 3,0 % поріг є дуже небезпечним і може привести до неконтрольованої ситуації з туберкульозу.

3. Запропоновано і впроваджено в практику модифікований метод пропорцій для постановки тесту медикаментозної стійкості з використанням 2-х контролів, як більш точний та економічний у порівняні з методами, що існували в Україні.

4. Вивчені біологічні властивості у резистентних до антимікобактеріальних препаратів штамів МБТ підтверджують, що стійкість супроводжується затримкою росту особин мікобактеріальної популяції, особливо при множинній медикаментозній стійкості. Масивність бактеріовиділення має тенденцію до росту по мірі збільшення числа хіміопрепаратів, до яких реєструється стійкість. Зниження активності каталази і пероксидази у окисно-відновних процесах мікробної клітини МБТ є допоміжним показником стійкості збудника до антимікобактеріальних препаратів, в першу чергу до ізоніазиду.

5. У хворих на туберкульоз легень L-форми МБТ були виділені у 43,6 % пацієнтів, в переважній більшості бактеріовиділювачів типових МБТ через 1 – 5 міс. після початку лікування. Виділені L-форми характеризувалися нестабільністю, виразною схильністю до реверсії in vitro в бактеріальну форму збудника в 71,3 % випадків, що свідчить про високий потенційний ризик їх переходу в бактеріальну форму в організмі хворого при сприятливих умовах.

6. Встановлено, що морфологічні, тинкторіальні, культуральні та ферментативні властивості ревертантних штамів, отриманих з нестабільних L-форм МБТ, повністю співпадають з властивостями типових МБТ, отриманих у тих же хворих, чутливість культур-ревертантів до антимікобактеріальних препаратів співпадає з такою у типових МБТ, виділених від одного і того ж хворого, а також вони зберігають вірулентність для морських свинок, яка притаманна збуднику туберкульозу.

7. Вивчено особливості розвитку M. tuberculosis на новому агаризованому поживному середовищі зі стимулятором росту та розроблено метод прискореної індикації і ідентифікації M. tuberculosis на його основі. Отримано патент на “Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих” та розроблена корисна модель “Спосіб визначення стійких до рифампіцину M. tuberculosis”. Нове агаризоване середовище дозволяє отримати культуру мікобактерій туберкульозу на 3 добу. Доведено, що отримана культура, яка має нетрадиційну для M. tuberculosis морфологію, є однією із стадій її розвитку.

8. Обґрунтовано необхідність проведення мікробіологічної діагностики туберкульозу за допомогою молекулярно-генетичного методу індикації комплексу
M. tuberculosis/bovis з використанням тест-набору MS-СКРИН, який дозволяє скоротити термін визначання наявності мікобактерій у хворого до однієї доби.

9. Ретроспективний аналіз даних показав, що в 1990 р. M. tuberculosis, чутливі до АМБП, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, в 2002 р. їх кількість не перевищувала 24,3 %, тобто за даний період часу цей показник знизився в 2,2 рази, а питома вага хіміорезистентних штамів МБТ зросла в 1,6 разів – з 46,5 % до 75,5 %.

Практичні рекомендації

1. Впровадження стандартизованих мікробіологічних методик дозволить покращити виявлення МБТ та визначення їх медикаментозної стійкості. Організація моніторингу за медикаментозною стійкістю МБТ можлива тільки завдяки використанню методу пропорцій, яка є пріоритетним завданням у контролі над епідемією хіміорезистентного туберкульозу в Україні.

2. Моніторинг за медикаментозною стійкістю МБТ особливо важливий для контингенту з вперше виявленим туберкульозом легень, тому що дані про первинну резистентність і спостереження за нею служать показником ефективності заходів щодо боротьби з туберкульозом. Впровадження “Електронної системи обліку стійкості до антимікобактеріальних препаратів у туберкульозі”, мікробіологічних основ організації і проведення моніторингу за медикаментозностійкими штамами M. tuberculosis та сформована концепція створення реєстру хіміорезистентного туберкульозу в Україні дозволить в короткий час налагодити централізований моніторинг за хіміорезистентним туберкульозом.

3. Інтенсивна хіміотерапія складає передумови формуванню варіантів МБТ зі суттєво зміненими біологічними властивостями. Виявлення нетипових форм мікобактерій туберкульозу може мати значення при підтвердженні діагнозу туберкульозу у осіб, які потребують особливого бактеріологічного контролю, коли виявити збудник рутинними мікробіологічними дослідженнями не вдається.

4. Обґрунтованим є застосування молекулярно-генетичних методів діагностики туберкульозу. Але, враховуючи високу вартість необхідного обладнання, раціональним є комплексне використання фено- та генотипічних методів дослідження в лабораторіях 4-рівня, з поступовим розширенням виконання цих методик в лабораторіях 3-го рівня, тобто на рівні обласних протитуберкульозних закладів України.

Публікації автора:

1. Динамика изменений спектра лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёза, выделенных от больных, находившихся на стационарном лечении в 1990 – 1999 гг. / Фещенко Ю.И., Журило А.А., Барбова А.И., Клименко М.Т., Самойленко С.И., Трохимова П.С., Вялых Ж.Э. // Укр. хіміотерапевт. журн. – 2000. – № 3. – С. 12 – 16. (Здобувачем було виділено штами мікобактерій туберкульозу і встановлено їх медикаментозну стійкість до протитуберкульозних препаратів).

2. Біологічні особливості L-форм мікобактерій туберкульозу, що виділені у хворих на туберкульоз легень / Чернушенко К.Ф., Журило О.А., Клименко М.Т., Барбова А.І., Ясир С.Г., В'ялих Ж.Е., Трофімова П.С. // Укр. пульмонол. журн. – 2002. – № 2. – С. 48 – 50. (Здобувачем досліджені біологічні властивості нестабільних L-форм мікобактерій туберкульозу).

3. Резистентність мікобактерій туберкульозу до фторхінолонів / Журило О.А., Барбова А.І., Клименко М.Т., Черенько С.О., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Іванкова О.В. // Укр. хіміотерапевт. журн. – 2002. – № 3 – 4. – С. 45 – 48. (Здобувач провів статистичну обробку та аналіз одержаних результатів, підготував матеріали до публікації).

4. Ситуація з мультирезистентного та полірезистентного туберкульозу в
м. Києві / Журило О.А., Турченко Л.В., Клименко М.Т., Барбова А.І., Трофімова П.С., В'ялих Ж.Е., Миронченко С.В., Бочко Н.В., Карнаухова М.М. // Укр. пульмонол. журн. – 2002. – № 3. – С. 36 – 39. (Здобувач проаналізував виділення мультирезистентних варіантів M. tuberculosis по стаціонару Інституту фтизіатрії і пульмонології).

5. Распространённость и структура лекарственной устойчивости M. tuberculosis у больных, находившихся на стационарном лечении в Институте фтизиатрии и пульмонологии в 2000-2002 гг. / Фещенко Ю.И., Журило А.А., Барбова А.И., Веселовский Л.В., Трохимова П.С., Миронченко С.В., Спасенко Е.В. // Укр. хіміотерапевт. журн. – 2003. – № 3 – 4(18). – С. 3 – 6. (Здобувачем проаналізована розповсюдженість стійких варіантів мікобактерій туберкульозу у 2000 р., проведена статистична обробка та аналіз одержаних результатів).

6. Ретроспективне дослідження первинної медикаментозної резистентності
M. tuberculosis у вперше виявлених хворих на туберкульоз легень по м. Києву за 2002-2003 рр. / Журило О.А., Барбова А.І., Клименко М.Т., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Карнаухова М.М., Бочко Н.В., Веселовський Л.В., Гаєва Л.В. // Укр. пульмонол. журн. – 2004. – № 3. – С. 8 – 10. (Здобувачем проаналізовано спектр медикаментозної стійкості штамів мікобактерій туберкульозу).

7. Визначення оптимального співвідношення дози ізоніазиду та вітаміну В₆ для лікування експериментального туберкульозу у морських свинок / Гайова Л.В., Барбова А.І., Трофімова П.С., Бобкова Л.С., Чубенко А.В. // Укр. хіміотерапевт. журн. – 2005. – № 1– 2(20). – С. 61 – 64. (Здобувач виконував експериментальні дослідження на морських свинках).

8. Біологічні властивості M. tuberculosis, виділених від хворих з первинною медикаментозною стійкістю / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Клименко М.Т., Ясир С.Г., Гайова Л.В. // Укр. пульмонол. журн. – 2005. – № 3. – С. 51 – 53. (Здобувач вивчив зміну біологічних властивостей штамів резистентних мікобактерій туберкульозу, узагальнив результати досліджень та підготував матеріал до друку).

9. Клинико-бактериологическая диагностика туберкулёзных плевритов / Фещенко Ю.И., Опанасенко Н.С., Журило А.А., Барбова А.И., Трохимова П.С., Миронченко С.В. // Укр. пульмонол. журн. – 2004. – № 4. – С. 34 – 37. (Здобувачем проведено дослідження клінічного матеріалу на наявність мікобактерій туберкульозу, аналіз та узагальнення результатів).

10. Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції / Фещенко Ю.І., Журило О.А., Барбова А.І., Клименко М.Т., Трофімова П.С., Власенко В.В. // Наказ МОЗ України № 45 від 06.02.2002. – 118 с. (Здобувач підготував розділи з генетичної діагностики туберкульозної інфекції).

11. Мікробіологічні методи обстеження хворих на туберкульоз (на підставі нових даних про особливості біологічного розвитку M.tuberсulosis) / Журило О.А., Власенко В.В., Барбова А.І., Конопко І.Г., Мирко Є.О., Черниш І.М., Василенко С.П., Трофімова П.С., В'ялих Ж.Е. // Метод. рекомендації. – 2001. – 24 с. (Здобувач дослідив особливості росту мікобактерій туберкульозу на новому середовищі).

12. Мікробіологічні основи проведення моніторингу за медикаментозною стійкістю штамів M. tuberculosis в України / Фещенко Ю.І., Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Веселовський Л.В., Спасенко О.В. // Метод. рекомендації. – 2004. – 24 с. (Здобувач брав участь у розробці принципів моніторингу за медикаментозною стійкістю штамів мікобактерій туберкульозу).

13. Патент 61674 Україна, МПК С12 N1/02, C12 Q1/02. Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В. – № 61674 А; Заявл. 26.03.2003; Опубл. 17.11.2003; Бюл. №11. (Здобувачем проведені всі необхідні мікробіологічні дослідження).

14. Патент № 12189 Україна, МПК С25 В11/00, С12 N1/02, C12 Q1/02. Спосіб визначення стійких до рифампіцину мікобактерій туберкульозу / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В. – № 12189; Заявл.16.08.2005; Опубл. 16.01.2006; Бюл. № 1. (Здобувачем визначені МІК рифампіцину на новому агаризованому середовищі).

15. Виділення L-форм мікобактерій туберкульозу при рецидивах туберкульозу легень / Чернушенко К.Ф., Журило О.А., Клименко М.Т., Барбова Г.І., Ясир С.Г., В’ялих Ж.Е., Циганкова Л.М., Трофімова П.С. // Інформ. лист. – 2000. – 4 с. (Здобувач виділив L-форми мікобактерій туберкульозу).

16. Критерій резистентності мікобактерій туберкульозу до фторхінолонів / Журило О.А., Клименко М.Т., Черенько С.О., Барбова А.І., Ясир С.Г., В'ялих Ж.Е., Трофімова П.С.// Інформ. лист. – 2001. – 4 с. (Здобувачем були встановлені МІК фторхінолонів по відношенню до лабораторного штаму M. tuberculosis Н₃₇R_v).

17. Критерій резистентності мікобактерій туберкульозу до ПАСК / Журило О.А., Барбова А.І., Клименко М.Т., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Ясир С.Г. // Інформ. лист. – 2005. – 4 с. (Здобувачем були встановлені МІК ПАСК по відношенню до лабораторного штаму M. tuberculosis Н₃₇R_v ).

18. Застосування методу ПЛР в діагностиці туберкульозу / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В. // Матеріали ІІІ з’їзду фтизіатрів і пульмонологів //Укр. пульмонол. журн. – 2003. – № 2. – С. 174. (Здобувачем був апробований на практиці метод ПЛР-дослідження за допомогою тест-ситеми для M. tuberculosis/bovis).

19. Вивчення молекулярних механізмів медикаментозної стійкості до рифампіцину штамів M. tuberculosis, виділених від хворих на вперше діагностований туберкульоз легень / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В. // Матеріали XIV з’їзду мікробіологів, епідеміологів та паразитологів. - Україна, Полтава, 2004. – С. 203. (Здобувач провів тестування штамів, які досліджувалися на чутливість до рифампіцину методом пропорцій).

20. Оцінка циркуляції хіміорезистентних варіантів M. tuberculosis в деяких регіонах України / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Ясир С.Г. // Матеріали XIV з’їзду мікробіологів, епідеміологів та паразитологів. - Україна, Полтава, 2004. – С. 202. (Здобувач провів статистичну обробку та аналіз одержаних результатів, підготував матеріали до публікації).