Анотація до роботи:

Ясна Н.С. Удосконалення методів аналізу білків в субстанціях та лікарських формах лаферону та ронколейкіну. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія.- Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, Київ, 2007.

Дисертацію присвячено питанням розробки методів аналізу біотехнологічних рекомбінантних білкових ліків Лаферобіону та Ронколейкіну. Відібрано оптимальні умови хроматографування лікарських форм вище означених білків. Показано, що зворотньофазова ВЕРХ з використанням градієнту ацетонітрила на колонках класу Нуклеосил-18 є оптимальним методом як кількісного, так і якісного аналізу лікарських форм. Окрім того, цей же метод можна успішно застосовувати для пептидного картування триптичних гідролізатів Лаферобіону та Ронколейкіну з метою підтвердження їх автентичності. Розроблений новий метод ферментативної регенерації колонок для ВЕРХ, який дозволяє від 10 до 100 разів підвищити терміни використання колонок для ВЕРХ. Експериментально відпрацьовані методики аналізу з використанням різних умов розділення для уніфікації інструментальних методів ВЕРХ, пульс-гель-електрофорезу, імуноферментного аналізу з метою їх включення до аналітичної нормативної документації.

1. Науково обґрунтовані шляхи удосконалення методів ідентифікації, кількісного аналізу та визначення супровідних домішок в субстанціях та лікарських формах альфа-інтерферону (Лаферону) та ІЛ-2 (Ронколейкіну); доведена перспективність включення методів високоефективної рідинної хроматографії, пульс-гель-електрофорезу до аналітичної нормативної документації на білкові ліки та встановлено їх кореляційний взаємозв’язок з біологічними методами вивчення активності Ронколейкіну і Лаферону; оптимізовано методологічні підходи до методів контролю якості Лаферону та Ронколейкіну на основі імуноферментного методу аналізу.

2. Вперше встановлено, що лінійний градієнт елюенту амонію гідрофосфату від 0 до 30% дозволив при мінімальній похибці розділити суміш білків та триптичних гідролізатів Лаферону при трикратному повторенні та найменшому часі проведення процедури розділення – до 10 хвилин включно.

3. Вперше встановлено, що трипсин не повністю гідролізує відновлену форму ІЛ-2; перед проведенням триптичного гідролізу його необхідно переводити в окислену форму.

4. Вперше встановлено, що при використанні ферментативної регенерації колонок для ВЕРХ, незважаючи на збільшення терміну їх експлуатації, розділення білків достовірно зменшує терміни служби колонок, що свідчить про наявність фракцій високомолекулярних речовин, стійких до використаних ферментів.

5. Вперше, завдяки регенерації зворотньофазових силікагелевих колонок за допомогою суміші ферментів обґрунтовано трикратне збільшення терміну їх експлуатації без зміни якості розділення.

6. Обгрунтовано оптимальний режим використання звротньофазової ВЕРХ з градієнтом ацетонітрилу від 0 до 60% для контролю якості Ронколейкіну.

7. Встановлено, що для аналізу Лаферону найбільш доступним та відтворюваним є метод розділення на йонообмінній диетиламіноетил-целюлозній ВЕРХ-колонці. Використання градієнту калію фосфату дає можливість чітко відокремити супровідні домішки від основної діючої речовини. Результати розділення Лаферону на ВЕРХ-колонці корелюють з результатами біологічних тестів.

8. Вперше обґрунтовано, що метод зворотньофазової ВЕРХ з градієнтом ацетонітрилу є оптимальним методом для інструментального підтвердження аутентичності білку за триптичним гідролізатом (пептидне картування) інтерлейкіну-2. Метод добре відтворюється, а колонки є доступними та недорогими.

9. Вперше доведено, що використання пульс-гель-електрофорезу дозволяє не тільки ідентифікувати низькомолекулярні білки та встановлювати наявність білкових домішок, але й встановити форму білку – денатуровану, окислену чи гібридизовану. Вперше встановлено, що застосування пульс-гель-електрофорезу на 10% поліакриламідному гелі при використанні ТРИС-буферного розчину чи трис-борат-буферу при рН=6,8 дозволяє досить точно та швидко відокремити один білок від іншого як у суміші трипсиногідролізату так і при використанні нативного білку.

10. Результати досліджень покладені в основу розробки змін до аналітичної нормативної документації, де біологічні методи контролю якості Лаферону та Ронколейкіну замінено на високоефективну рідинну хроматографію та пульс-гель-електрофорез.

Публікації автора:

Статті у наукових фахових виданнях:

1. Ясна Н.С., Мартинов А.В. Порівняння ефективності фармакопейного біологічного методу встановлення активності (концентрації) ронколейкіну з імуноферментним і ВЕРХ – методами // Фармац. журн. - 2006. - № 1. - С. 70-73. (Дисертант особисто приймала участь у проведенні досліджень, написанні статті, узагальненні матеріалу).

2. Ясна Н.С., Шевцов І.М., Мартинов А.В., Костіна Т.А., Кисличенко В.С. Методологічні особливості використання імунологічних серологічних методів для якісного та кількісного аналізу наднизької кількості високомолекулярних лікарських засобів в лікарських формах // Фармац. журн. - 2005. - № 6. - С.54-59. (Дисертант особисто приймала участь у проведенні досліджень, написанні статті, узагальненні матеріалу).

3. Ясна Н.С. Удосконалення методів регенерації колонок для високоефективної рідинної хроматографії, які використовуються для розділення високомолекулярних речовин // Фармац. журн. - 2007 . - № 2. - С. 81-84.

4. Ясна Н.С., Мартинов А.В., Костіна Т.А., Кисличенко В.С. Високоефективна рідинна хроматографія лікарських засобів білкової природи в пікомольних кількостях // Фармац. журн. - 2006. - № 2. - С. 38-47. (Дисертант особисто приймала участь у проведенні досліджень, написанні статті, узагальненні матеріалу).

5. Городницька Н.І., Ясна Н.С., Мартинов А.В., Чернявський В.І., Козубова Г.М., Смілянська М.В., Осолодченко Т.П., Перемот С.Д., Романова О.А., Ігумнова Н.І., Сидоренко Т.А. Сучасний стан розробки хімічних вакцин для профілактики синьогнійної інфекції // Анн. Мечн. Інст-ту. - 2006. - № 3. - С. 4-17. (Дисертант особисто готувала розділ огляду, повязвний з хроматографічним виділенням, очищенням та стандартизацією білків синьогнійної палички з використанням ВЕРХ).

Тези доповідей:

6. Эпидемиологические и биологические особенности возбудителей сальмонеллеза людей и животных / С.А. Рыженко, Л.М. Сладкова, Н.М. Школьная, А.Г. Дьяченко, И.А. Воронкина, В.Ф. Шаповал, Л.М. Руденко, Н.С. Ясная, Н.П. Донец, Ю.В. Шатилло // Поиск и разработка новых иммунобиологических препаратов, профилактических и лечебных противомикробных средств, антисептиков, дезинфектантов и пробиотиков: Материалы международной научно-практической конференции (20-21 ноября 2006 года. - Харьков, 2006. - С. 22 (Дисертант особисто досліджувала кон’югати інтерферону з адгезинами сальмонели та готувала тези).

7. Ясная Н.С., Волянский Д.Л., Балута И.М., Дубинина Н.В., Волков А.А., Вальчук С.И., Лебедева И.Ю. Современные методические подходы к изучению адгезивных свойств клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов // Поиск и разработка новых иммунобиологических препаратов, профилактических и лечебных противомикробных средств, антисептиков, дезинфектантов и пробиотиков: Материалы международной научно-практической конференции (20-21 ноября 2006 года. - Харьков, 2006. - С. 28. (Дисертант особисто досліджувала кон’югати інтерферону з адгезинами мікроорганізмів та готувала тези).

Методичні рекомендації:

8. Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій / Ю.Л. Волянський, С.І. Похил, С.В. Бірюкова, С.А. Деркач, Н.Ф. Дзюбан, А.І. Носатенко, Н.С. Ясна, О.І. Клімов, І.Ю. Кучма, О.В. Стольнікова, В.М. Козько, І.А. Крилова, Е.О. Чулей, Н.П. Волянська, М.І. Краснов, О.О. Тарасов, В.Б. Стороженко, В.І. Лучик, М.Г. Божко, І.А. Вороніна, О.Я. Строга, С.А. Черняєв, В.Ф. Шаповал, Б.І. Панамарь // Методичні рекомендації МОЗ України. - Харків, 2005. - 53 с. (Дисертант особисто підготувала розділ із описом та методичними підходами щодо сучасних методів ідентифікації інфекційних білків з використанням ІФА, ВЕРХ).

Звіти про виконання НДР:

9. Забезпечити підвищення ефективності щеплень населення шляхом використання технології ацилювання білкових та полісахаридних мікробних антигенів: Звіт про НДР (заключний)/ Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України. - АМН 71/2006, номер державної реєстрації 0106U003264. - 82 с. (Дисертантом розроблена методика кількісного визначення інтерлейкіну-2 з використанням ВЕРХ як ад’юванта вакцин, підготовлений відповідний розділ звіту).

10. Ацильовані похідні білків та полісахаридів антигену синьогнійної палички, розробка на їх основі вакцин: Звіт про НДР (проміжний)/ Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України.- шифр теми АМН 70/2006, номер державної реєстрації 0106U003265 ). - 46 с. (Дисертантом особисто розроблена методика кількісного визначення інтерлейкіну-2 як ад’юванта вакцин методик пульс-гель-електрофорезу, підготовлений відповідний розділ звіту).