271. Тимченко Олена Миколаївна. Удосконалення молекулярно-генетичних методів внутрішньовидового епідеміологічного типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп: дис... канд. мед. наук: 03.00.07 / АМН України; Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова. - Х., 2004. , табл.
Анотація до роботи:
Тимченко О.М. Удосконалення молекулярно-генетичних методів внутрішньовидового епідеміологічного типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. –Харків, 2004.
В роботі представлені результати досліджень з удосконалення та прикладного застосування методів внутрішньовидового епідеміологічного генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою визначення у них плазмідного профілю (ПП) та аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК).
Вперше, на основі експериментально-апробованих, ефективних методів руйнування клітин мікроорганізмів різних таксономічних груп створено уніфіковані технології внутрішньовидового генотипування методом визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК та розроблені стандартизовані критерії оцінки ідентичності електрофоретичних профілів для визначення генетичної спорідненості штамів.
Вивчено біологічні властивості 17-ти штамів S. aureus subsp. aureus, ізольованих в осередку шпитальної гнійно-септичної інфекції і 50-ти штамів S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis, виділених при спорадичній та груповій захворюваності людей на сальмонельоз. Проведено внутрішньовидове епідеміологічне фено- і генотипування (визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК) штамів стафілококів і сальмонел. Підтверджено, що між визначеними фено- і генотипами мікроорганізмів немає чіткої кореляційної залежності.
1. Із семи експериментально апробованих технологій руйнування клітин мікроорганізмів найбільш ефективними (за показниками: % зруйнованих клітин бактерій, концентрація звільненої ДНК, рівень цілісності молекул плазмідної та хромосомної ДНК) для застосування з метою генотипування є методи швидкого міні-лізису (МШМЛ), тритонового лізису (МТЛ) та лізису в агарозних блоках (МЛАБ).
2. За результатами досліджень удосконалено методи генотипування мікроорганізмів - визначення плазмідного профілю (ПП) і аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК), які доцільно використовувати для внутрішньовидового епідеміологічного типування мікроорганізмів різних таксономічних груп.
3. Уніфікована нами технологія генотипування збудників інфекційних захворювань методом визначення ПП включає проведення поетапних досліджень для встановлення факту наявності у штамів плазмід і їх наближеного розміру з допомогою модифікованого варіанту МШМЛ (перший етап визначення ПП) та наступне визначення ідентичності плазмід за результатами їх сайт-специфічної ендонуклеазної рестрикції (другий етап визначення ПП).
4. Технологія генотипування збудників методом АПДФЕР ХрДНК включає п’ять послідовних уніфікованих етапів дослідження: накопичення біомаси мікроорганізмів шляхом їх вирощування на стандартних поживних середовищах; вилучення, очищення та іммобілізацію ХрДНК з допомогою модифікованого варіанту МЛАБ; проведення сайт-специфічної рестрикції ХрДНК ендонуклеазами з оптимально підібраними сайтами впізнавання; розділення рестрикційних фрагментів ХрДНК за допомогою електрофорезу в пульсуючому полі; візуалізація електрофоретичних профілів (ЕФП) і визначення генетичної спорідненості штамів з використанням уніфікованих критеріїв оцінки ідентичності (відмінності) фінгерпринтів.
5. За результатами вивчення біологічних властивостей (морфологічних, тінкторіальних, культуральних, біохімічних) 17 штамів стафілококів, ізольованих в осередку шпитальної ГСІ, віднесено до виду S. aureus subsp. aureus. Між парами основних біологічних властивостей (лецитовітелазною, коагулазною, ДНК-азною, фосфатазною, гемолітичною активністю, ферментацією маніта в анаеробних умовах, резистентністю до новобіоцину) виявлено слабкий кореляційний зв’язок (із значенням rф від –0,06 до 0,35). Вказане підтверджує доцільність застосування при дослідженні біологічних властивостей стафілококів принципу поєднання декількох позитивних результатів тестів для їх ідентифікації або міжвидової диференціації.
6. Культури сальмонел, ізольовані від хворих людей при спорадичній захворюваності на гостру кишкову інфекцію (15 штамів) та в осередку групової захворюваності на сальмонельозну харчову токсикоінфекцію (35 штамів), за вивченням морфологічних, тінкторіальних, культуральних, біохімічних, серологічних властивостей віднесено до виду S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis. Всі 50 штамів характеризувались високим рівнем монотипності біохімічних властивостей, 95% із них були однотипними в тестах ферментації цукрів, спиртів, амінокислот. Культури сальмонел різного походження відрізнялись за здатністю ферментувати арабінозу, L,D-тартрат, чутливістю до сальмонельозного індикаторного О-фагу та полікомпонентного лікувального сальмонельозного бактеріофагу груп А, В, С, D, Е.
7. Застосування для внутрішньовидового епідеміологічного типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп методів фенотипування (фаго-, антибіотикорезистенстипування для стафілококів, та біо- і антибіотикорезистенстипування для сальмонел), а також генотипування (визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК) дозволяє диференціювати штами і групувати їх за подібністю фено- та генотипу, визначати епідемічно-домінуючі клони та взаємозв’язки між ними. Між фено- і генотипами, що були визначені у штамів стафілококів і у штамів сальмонел, не виявлено чіткого кореляційного зв’язку.
8. На теперішній час співвідношення між методами фено- і генотипування слід оцінювати в площині взаємодоповнення, а не протиставлення. Удосконалені методи генотипування (визначення ПП, АПДФЕР ХрДНК) при порівнянні із традиційними методами фенотипування характеризуються вищою уніфікованістю технології проведення досліджень, достатнім рівнем чутливості, дискримінантності, більш високим рівнем відтворюваності результату.
9. Широкомасштабне прикладне застосування методів генотипування для тестування клінічно-значущих мікроорганізмів, що ізольовані в різні періоди перебігу епідемічного процесу, дозволить виявити особливу групу генетичних ознак – маркерів формування епідемічних варіантів збудників інфекційних захворювань.
2. Тимченко О.М. Генотипування госпітальних штамів Staphylococcus aureus subsp. aureus за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів рестрикції хромосомної ДНК // Експериментальна і клінічна медиц.–2004.-№2. –С. 72-75.
3. Тимченко О.М., Похил С.І., Федоров Е.І., Деркач С.А., Подаваленко А.П., Волянська Н.П., Мішукова Т.А., Осолодченко Т.П. “Епідеміологічне, внутрішньовидове генотипування енте-робактерій – збудників інфекційних захворювань” (методичні рекомендації) –Харків, 2003. –43 с. (Здобувач – відповідальний за видання цієї роботи. Удосконалив і уніфікував молекулярно-гене-тичні методи ЕТ мікроорганізмів (МШМЛ, ВТВП, МЛАБ та ін.), розробив критерії оцінки результатів ЕТ з використанням методів АПП і АПДФЕР ХрДНК. Підготував матеріали до друку).
4. Тимченко Е.Н., Волянский Ю.Л., Похил С.И. Анализ рестрикционного картирования ДНК как метод современного типирования возбудителей инфекционных заболеваний // Вісник проблем біології та медицини.– 1997. – Вип. 32. –С. 78-86. (Тимченко О.М. проаналізувала і узагальнила дані наукової літератури щодо внутрішньовидового ЕТ мікроорганізмів методом АПДФЕР ХрДНК, обґрунтувала уніфікований протокол досліджень та запропонувала критерій для вибору ендонуклеаз для сайт-специфічного РА ХрДНК).
5. Цыганенко А.Я., Тимченко Е.Н., Похил С.И. Рестрикционное картирование ДНК - как современный метод классификации бактерий // Вісник проблем біолог. та медицини. –1998. –Вип. 2. –С. 16-26. (Здобувач вивчив і систематизував дані наукової літератури стосовно існуючих принципів класифікації бактерій, в т. ч. методів геносистематики. Обґрунтував доцільність використання для ідентифікації та типування мікроорганізмів порівняльного аналізу їх геномів методом сайт-специфічної рестрикції ХрДНК).
6. Федорова Л.Г., Ліман Н.Г., Яковлева З.І., Тищенко Т.В., Тонкошкур Т.І., Бондаренко А.В., Тимченко О.М., Похил С.І., Козюпа С.М. Фено- та генотипування клінічних штамів Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Salmonella Enteritidis) // Сб. матер. 6-ой итоговой региональной науч.-практ. конф. посвящ. 80-летию санэпидслужбы МОЗ Украины. – Харьков, 2003. – Часть I. –С. 137-145. (Здобувач виконав експериментальну роботу – вивчив біологічні властивості та провів фено- і генотипування клінічних ізолятів сальмонел, підготовив матеріали до публікації).
7. Циганенко А.Я., Тимченко О.М., Похил С.І. Завдання і шляхи подальшого удосконалення генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК // Експеримент. і клінічна медиц. –2002. -.№3. –С. 79-83. (Здобувач провів підбір і аналіз наукової літератури з даної проблеми, обґрунтував напрямки досліджень для подальшого удосконалення методу АПДФЕР ХрДНК з метою визначення генетичної спорідненості мікроорганізмів, підготовив матеріали до публікації).
8. Похил С.И., Красовский В.В., Тимченко Е.Н. Определение объема (веса) инокулята, наносимого с использованием репликатора Семенихиной // Клин. лаб. диагн. (Москва). - 1998. - №7. -С. 34-36. (Здобувач виконав експериментальну частину роботи та провів статистичну обробку результатів досліджень).
9. Похил С.І., Лиманський О.П., Тимченко О.М., Юдін І.П., Волянська Н.П. Спосіб епідеміологічного, внутрішньовидового генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізма довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК // Інформаційний бюлетень (Додаток до “Журналу Академії медичних наук України”). –Київ, 2002. –Випуск 15. –С. 30. (Здобувач розробив уніфікований протокол проведення АПДФЕР ХрДНК для ЕТ ЗІЗ, обґрунтував критерії оцінки результатів їх генотипування).
10. Технологія визначення плазмідного профілю у культур бактерій - сучасний метод епідеміологічного типування збудників гострих кишкових інфекцій (ГКІ)/ Похил С.І., Тимченко О.М., Бондаренко А.В., Волянська Н.П. // Реєстр галузевих нововведень. – МОЗ України, УкрЦНМІПЛР. –Київ, 2000. –Вип. 12-13. –Реєстр. № 118/13/00. –С. 62-63. (Здобувач удосконалив технологію визначення ПП у мікроорганізмів різних таксономічних груп та провів експеримен-тальне випробовування цього методу генотипування при ЕТ ентеробактерій – збудників ГКІ).
