Анотація до роботи:

Медведовська М.І. Вплив технологічних чинників на отримання та культивування тотипотентних клітин миші. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20. – біотехнологія. Білоцерківський державний аграрний університет, Біла Церква, 2007.

У дисертації розглянуті основні технологічні фактори, що здійснюють вплив на отримання та культивування поза організмом тотипотентних клітин миші. Визначені та удосконалені умови і методи отримання та довгострокового культивування ембріональних фібробластів миші, культуру яких використовують у якості фідерного шару для розвитку тотипотентних клітин ссавців. Визначені умови і методи ефективного отримання клітин-попередників ЕСК. Запропоновано більш простий та щадячий спосіб трипсинізації ЕС-подібних клітин та ембріональних фібробластів миші. Доведено можливість довгострокового культивування ЕС-подібних клітин миші зі зберіганням їх недиференційованого стану. Модифіковано метод культивування тотипотентних бластомерів миші з метою збільшення ідентичного генетичного матеріалу. Представлено ілюстративний матеріал, що послідовно відображає всі стадії розвитку ембріональних фібробластів, ЕС-подібних клітин та ізольованих тотипотентних бластомерів миші у культурі.

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове практичне вирішення проблеми удосконалення технології отримання та культивування тотипотентних бластомерів і ЕС-подібних клітин, яке досягається за рахунок:

• використання фідерного моношару ембріональних фібробластів миші;

• селективного підходу до вибору способу дезагрегації ембріональних клітин: для бластомерів і клітин-попередників ЕСК – піпетуванням у безкальцієвому середовищі та для ембріональних фібробластів і ЕС-подібних клітин –трипсинізацією, режими якої дозволяють отримувати життєздатні клітини;

• розробки окремо для кожного типу ембріональних клітин відповідної концентрації глюкози культурального середовища при постійному підвищеному рівні глютаміну.

2. Трипсинізація ембріонального матеріалу у розчині 0,25% трипсин – 0,2% ЕДТА протягом 10 хвилин забезпечує утворення суспензії життєздатних клітин для отримання культури ембріональних фібробластів миші. Для пасування ембріональних фібробластів концентрація розчину даного ферменту має становити 0,05% трипсин – 0,02% ЕDТА, а час ферментативної обробки не повинен перевищувати 3 хвилини.

3. Довгострокове культивування ембріональних фібробластів миші є можливим протягом 7 – 10 пасажів. У відсутності пасування фібробласти проліферують у культурі протягом 5 діб, потім починаються процеси деградації, які призводять до загибелі культури.

4. Фідерний моношар ембріональних фібробластів миші є життєздатним протягом 4 діб підтримання в умовах in vitro. Його використання забезпечує вихід бластоцист миші із зони пеллюцида з подальшим формуванням клітин-попередників ЕСК, ЕС-подібних клітин, проліферацію ЕС-подібних клітин та ізольованих тотипотентних бластомерів миші.

5. Концентрація глютаміну 2 мг/мл у культуральному середовищі забезпечує стабільний розвиток ембріональних клітин миші in vitro. Концентрація глюкози 2 мг/мл у культуральному середовищі є достатньою для розвитку клітин ВКМ ембріонів та ембріональних фібробластів миші. Її концентрація 5,5 мг/мл забезпечує формування та пасування ЕС-подібних клітин миші. Концентрація у середовищі глюкози 1 мг/мл є достатньою для проліферації у культурі тотипотентних бластомерів миші.

6. Стимулюючий вплив ембріональних фібробластів на формування ЕС-подібних клітин дозволяє уникнути етапу використання пронази, хоча її 0,5% розчин не впливає на подальший розвиток ембріонів з утворенням клітин ВКМ та ЕС-подібних клітин.

7. Модифікація методу трипсинізації ЕС-подібних клітин за рахунок піпетування у розчині ферменту 0,05% трипсин – 0,02% ЕDТА при постійному мікроскопічному контролі дозволяє досягнути розвитку ЕС-подібних клітин у культурі зі зберіганням їх недиференційованого стану протягом не менш 10 пасажів.

8. Якісні відмінності, що мають місце в процесі дроблення, не є компетентними по відношенню до тотипотентності бластомерів, ізольованих від 2-х, 4-х та докомпактизаційних 8-и клітинних ембріонів. Восьмиклітинна стадія розвитку мишачих ембріонів є перехідною з точки зору зберігання бластомерами тотипотентності.

9. Культивування на фідерному моношарі ембріональних фібробластів забезпечує проліферацію тотипотентних бластомерів миші, ізольованих від 2-, 4- та 8-клітинних зародків, до 8-10 клітин з утворенням колоній ЕС-подібного типу. Зі збільшенням кількості мітотичних циклів у культурі відбувається зменшення потенцій ізольованих тотипотентних бластомерів до розвитку.

Публікації автора:

1. Яковлева М.И., Щербак Е.В., Гордиенко Н.А. Проблемы и перспективы использования эмбриональных стволовых клеток в медицине // Медицина сьогодні і завтра. – 2004. - №2. - С. 75 – 76.

2. Яковлєва М.І., Щербак О.В. Деякі аспекти культивування поза організмом доімплантаційних ембріонів мишей з метою отримання плюрипотентних клітин // НТБ Ін-ту Біології тварин УААН. – Львів. – 2004.- В. 5. - № 3. – С. 226 – 228.

3. Щербак О.В., Яковлєва М.І. Культивування ембріонів миші для отримання клітин-попередників ЕСК // Тез. ІІ Всеукр. наук.-практ. конф. „Біотехнологія. Освіта. Наука”. – Львів. – 2004. – С. 110.

4. Яковлєва М.І., Щербак О.В. Удосконалення умов і середовищ для отримання та культивування тотипотентних клітин мишей // НТБ. - № 89. – Х.: ІТ УААН. – 2005. – С. 172 – 177.

5. Стрельников Л.С., Яковлева М.И., Щербак Е.В., Стрилец О.П. Использование биотехнологических методов для создания трансплантантов органов человека // Мат. VІ Націон. з’їзду фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”. – Х.: НФаУ. – 2005. – С. 368 – 369.

6. Яковлєва М.І., Щербак О.В. Отримання культури первинних ембріональних фібробластів миші // Наукові вісті НТУ України. – „КПІ”. – 2005. - № 6 (44). – С. 139 – 142.

7. Медведовская М.И., Щербак Е.В. Получение тотипотентных клеток мыши для использования в целях современных биотехнологий // Мат. ІІ Міжнародн. наук.-практ. конф. „Сучасні наукові дослідження – ‘2006”. - Дніпропетровськ: Наука і освіта. – 2006.– Т. 20. – С. 8 – 10.

8. Медведовська М.І., Щербак О.В. Отримання та культивування ЕС-подібних клітин мишей // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. – Львів. – Т. 8. - № 2 (29). – Частина 2. – 2006. – С. 96 – 101.

9. Medvedovska M.I. Embryoid bodies formation as an initial stage of ES-like cells differentiation in mice // Матеріали ІІІ Міжнародної науково-практичної конференції „Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика –‘2006”. – Дніпропетровськ: Наука і освіта. – 2006. – Т. 2. – С. 49 – 51.

10. Медведовська М.І. Вплив умов культивування на розвиток in vitro бластомерів, отриманих від ранніх ембріонів миші // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. – Львів. – Т. 8. - № 3 (30). – Частина 2. – 2006. – С. 102 – 108.